Sentez ve rutenyum tabanlı mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü değerlendirilmesi
Summary
Bir protokol, arıtma, malzemelerin ve rutenyum tabanlı inhibitörü olan mitokondrial kalsiyum alımı için sunulmaktadır. Permeabilized memeli hücrelerinde onun etkinliğini değerlendirmek için bir yordam gösterilmiştir.
Abstract
Sentez ve bir mitokondri kalsiyum alımını inhibitörü, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]5 +arıtma ayrıntı. Bu bileşik bir en iyi duruma getirilmiş sentez [Ru (NH3)5Cl] Cl2 den 1 M NH4OH yeşil bir çözüm verimli kapalı bir kap içinde başlar. Arıtma katyon değişim Kromatografi ile gerçekleştirilir. Bu bileşik ile karakterize olan ve saf olmak UV-VIS ve IR spektroskopisi tarafından doğrulandı. Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitör özellikleri permeabilized HeLa hücreleri Floresans spektroskopisi tarafından değerlendirilir.
Introduction
Mitokondrial kalsiyum enerji üretimi ve Apoptozis dahil olmak üzere normal hücre işlevi için kritik süreçlerin bir dizi için anahtar bir düzenleyicisidir. 1 , 2 , 3 mitokondrial kalsiyum uniporter (MCU), iç mitokondrial membran üzerinde bulunduğu bir iyon taşıyıcı protein kalsiyum iyonları akını mitokondri düzenlemektedir. 4 , 5 , 6 MCU kimyasal inhibitörleri çalışmaları bu taşıma protein ve mitokondrial kalsiyum hücresel roller ve işlev çalışmaya devam değerli araçlardır. Bileşik [(HCO2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, MCU bildirilen Kd değeri olan 24 µM.7 için tek bilinen seçici inhibitörleri biridir Bu karmaşık ortak bir kirlilik ticari formülasyonları ve rutenyum kırmızı (RuRed), bir triruthenium di-μ-oxo bulunan ,8,9,10 köprü hexacation Formula [(NH3) 5 Aynı zamanda kalsiyum alımını inhibitörü olarak kullanılan (μ-O) Ru Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +. Ru360 ticari olarak mevcut olmasına rağmen çok pahalıya mal olur. Ayrıca, sentez ve Ru360 yalıtım, meydan zor arıtma işlemleri ve belirsiz karakterizasyon yöntemleri tarafından.
Son zamanlarda bir Ru360 analog, [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5erişmek için alternatif prosedürler bildirdin. 11 bu bileşik ile yüksek afinite, Ru360 için benzer MCU engeller. Bu protokol için [Ru (NH3)5Cl] Cl2den başlar bizim en etkili sentezi olan bu bileşik anlatacağız. Arıtma kesinlikle asidik katyon değişim reçine kullanarak ürün ile birlikte ortak tuzaklar bu yordam için detaylı. Ayrıca, karakterizasyonu ve bileşik saflık değerlendirme yöntemleri sunmak ve mitokondrial kalsiyum alımını engelleme onun etkinliğini test etmek için basit bir yaklaşım betimlemek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrial kalsiyum alımını inhibitörü [(OH2) (NH3)4(μ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 sentezlenmiş [Ru (NH3)5Cl] Cl2, iyi bilinen bir ruthenium(III) olabilir malzeme, bu yordamda açıklandığı gibi başladı. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 sentezi kolayca küçük zorlukla elde edilir. 16 h için RuCl3 hidrazin içinde karıştırma sonra hidrat, çözüm pH HCl ile 2 değeri…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Cornell Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Bu eser Cornell Merkezi malzemeleri araştırma paylaşılan Tesisatı, NSF MRSEC programı (Grant DMR-1120296) ile desteklenen için kullanın yaptı. S.R.N. destek bir NSF yüksek lisans araştırma bursu (Grant DGE – 1650441) ve Dr Dave Holowka kalsiyum deneyler hakkında yardım almak için kabul eder. Herhangi bir görüş, bulgular ve sonuç ya da öneriler bu malzeme ifade yazarlar (s) ve mutlaka Ulusal Bilim Vakfı görüşlerini yansıtmamaktadır.
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
Referencias
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Bioquímica. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of “ruthenium red” responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
