ルテニウムによるミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤の合成と評価
Summary
合成・精製・ ミトコンドリアのカルシウム吸収のルテニウム系阻害剤の特性のためのプロトコルが表示されます。グリセリンの哺乳類細胞に対する有効性を評価するための手順が示されています。
Abstract
我々 は、合成、精製、ミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤 [(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)]5 +を詳しく説明します。この化合物の最適化された合成開始 [Ru (NH3)5Cl] Cl2から 1 M で NH4密閉容器、緑のソリューションを降伏ああ。陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製が行われます。この化合物は特徴あり紫外可視・赤外分光によって純粋に確認します。蛍光分光法によるグリセリンの HeLa 細胞におけるミトコンドリアのカルシウム吸収抑制プロパティを検索します。
Introduction
ミトコンドリアのカルシウムは、エネルギー生産、アポトーシスなどの正常な細胞機能に不可欠なプロセスの数の重要な調節因子です。1,2,3ミトコンドリアのカルシウム単一輸送体 (MCU) 内のミトコンドリア膜に存在するイオン運送者蛋白質はミトコンドリアにカルシウム イオンの流入を調節します。4,5,6 MCU の化学阻害剤は、継続関数、この輸送蛋白質とミトコンドリアのカルシウムの細胞の役割を研究するための貴重なツールです。化合物 [(HCO2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +Ru360、7 は、24 μ M の報告 Kd値と MCU の唯一知られている選択的阻害剤の一つです。 ,8,9,10この複合体は一般的な不純物の商業配合ルテニウム赤 (RuRed) ドデカカルボニル ジ-μ-オキソ架橋式 [(NH3) の hexacation5Ru (μ-O) Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +、カルシウム吸収の阻害剤としても使用されています。Ru360 は、市販されている、非常に高価です。また、困難な浄化手順やあいまいな評価方法で合成と Ru360 の分離に挑戦します。
我々 は最近、Ru360 アナログ、[(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5にアクセスする代替手段を報告しています。11この化合物は、親和性の高い、Ru360 のように MCU を阻害します。このプロトコルでは、[Ru (NH3)5Cl] Cl2から開始の化合物は、私たちの最も効果的な合成を説明します。この手順の一般的な落とし穴と、強酸性陽イオン交換樹脂を用いた製品の精製の詳細です。また特性と化合物の純度の評価の手法を提示し、ミトコンドリアのカルシウム吸収をブロックでその有効性をテストするための単純なアプローチの輪郭を描きます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤 [(OH2) (NH3)4とらぶる (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] から合成された Cl2、よく知られている ruthenium(III) をすることができます。開始材料は、この手順で説明するよう。[Ru (NH3)5Cl] Cl2の合成は少し難しさと容易に実現できます。水和ヒドラジンの 16 h ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、コーネル大学によって支えられました。この作品は、材料研究共有施設、NSF MRSEC プログラム (助成金 DMR 1120296) を通じてサポートされるコーネル大学センターを利用しました。S.R.N. は、NSF 大学院研究員 (グラント DGE-1650441) およびカルシウム実験について博士デーブ Holowka によるサポートを認めています。意見、所見、結論または本資料に示した推奨事項著者 (s) のものし、国立科学財団の見解を必ずしも反映されません。
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
Referencias
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Bioquímica. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of “ruthenium red” responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
