Summary

Eine automatisierte rasche Iterative Negative Geotaxis Assay für die Analyse von Erwachsenen Klettern Verhalten in einem Drosophila -Modell der Neurodegeneration

Published: September 12, 2017
doi:

Summary

Dieses schrittweise Protokoll analysiert Drosophila negative Geotaxis Verhalten mit einem automatisierten Multi-Zylinder-System, das beherbergt hunderte von fliegen und synchronisiert ihre Aktion durch einen Elektromotor. Bei der Synchronisation ist fliegen negative Geotaxis Verhalten untersucht, digital erfasst und analysiert mit Hilfe der selbst entworfenen RflyDetection-Software.

Abstract

Neurodegenerative Erkrankungen gehen häufig einher mit einem fortschreitenden Verlust der Bewegungsfähigkeit, reduzierten Lebensdauer und altersabhängigen Neurodegeneration. Um zu verstehen, den Mechanismus dieser zelluläre Ereignisse und ihre kausale Beziehungen zueinander, Drosophila Melanogaster, mit seiner genetischen Spezialtools und vielfältige Verhaltensstörungen Funktionen, Krankheitsmodelle für die Beurteilung dienen als Neurodegenerative Phänotypen. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur Drosophila Erwachsene negative Geotaxis Verhalten, als Hinweis auf mögliche motor Mängel verbunden mit neurodegenerativen Erkrankungen zu analysieren. Eine automatische Maschine konzipiert und entwickelt für Antrieb fliegen Synchronisierung verwenden einen ersten elektrischen Impuls, so dass später die Aufnahme der negative Geotaxis Verhalten über einen Verlauf von Sekunden bis Minuten. Bilder von Digital aufgenommenen Videos werden dann mit der selbst gestalteten RflyDetection-Software für statistische Datenmanipulation verarbeitet. Anders als die manuell gesteuerte negative Geotaxis Assay basierend auf Fliege, präzise, schnell und Hochdurchsatz-Protokolls ermöglicht Datenerfassung von mehr als Hunderte von fliegen, gleichzeitig eine effiziente Herangehensweise voraus unsere Verständnis in den zugrunde liegenden Mechanismus der motorischen Defizite verbunden mit neurodegenerativen Erkrankungen.

Introduction

Eine Vielzahl von Protokollen und Methoden wurden für die Analyse von Drosophila Erwachsenen Klettern Verhalten entwickelt. Eher mühsam, die traditionelle Analyse meistens geht es darum eine Fliege in einem einzelnen Fläschchen und nutzt eine manuelle Kraft zu fliegen nach unten für Synchronisation1,2,3,4Tippen Sie auf. Es ist mühsam und zeitraubend, ungeeignet für große Hochdurchsatz-Studien und Variationsmöglichkeiten der verwendet, um die fliegen sowie andere Einschränkungen Tippen Sie auf manuelle Kraft hat. Um den Test zu verbessern, wurde ein schnelle Iterative Negative Geotaxis (RING) Assay entwickelt die Hochdurchsatz-Analyse über zahlreiche fliegen in der gleichen Zeit5ermöglicht. Der Test erfordert jedoch noch eine manuell auszuüben Kraft zu fliegen Aktion synchronisiert. Unsere Version des RING-Assays, überarbeitet nach der vorherigen Test enthält eine Metallbasis mehrere fliegen-haltigen Fläschchen automatisch gesteuert durch einen Elektromotor fliegen Synchronisation6fahren hosten. Bei der Aufnahme, die Fliege, die Besteigung sofort nach einer Synchronisation dann aufgezeichnet wird mit eine selbst entworfene Software analysiert. Unsere automatisierten RING-Assay hat eliminiert die mühsamen und arbeitsaufwändiger Prozess bei der Erhebung von Daten aus einer Fliege, einzeln nacheinander, und aktiviert die Datenerfassung effizienter. Darüber hinaus ist der automatisierte RING-Test in einer Reihe von Studien klären Mechanismus zugrunde liegenden Alzheimer und Parkinson, Validierung des Ansatzes mit hohem Wirkungsgrad7,8,9 beschäftigt .

In diesem Artikel zeigen wir die automatisierte RING-Assay mit DDC-Gal4 getrieben RNAi fliegen. DDC-Gal4 ist eine Gal4-Linie, die speziell mit dem Ausdruck (DA) dopaminergen und serotonergen Neuronen, stellvertretend für ein großartiges Werkzeug für die Analyse der Ziel-gen Auswirkungen im Zusammenhang mit motorischen Defizite begleitenden Neurodegeneration10. Darüber hinaus integrieren wir UAS-Dicer2, eine Fliegenschnur, die RNAi-Effizienz, um die FH-Dicer2 generieren erhöht; DDC-Gal4 Werkzeug Linie. Die RNAi fliegen wir wählen zu verwenden ist die Auxilin (Aux) RNAi v16182 (AuxR16182), ein Gen, das wir zuvor identifiziert haben, um einen Effekt auf ausstellen fliegen lokomotorische Aktivität8. AuxGFP fliegen sind auch bereit, für die Analyse von Auswirkungen auf die Aux -Überexpression. Wir zeigen, wie Sie mithilfe den automatisierten RING-Test messen fliegen negative Geotaxis, präsentieren die Ergebnisse und Auswirkungen gewonnenen Ergebnisse zu diskutieren.

Protocol

1. fliegen Sammlung die fliegen auf standard fliegen Essen bei 25 ° C, 70 % Luftfeuchtigkeit und einer 12 h/12 h hell/dunkel-Zyklus zu erhalten. Sammeln FH-Dicer2; DDC-GAL4 fliegen Virginsunder Kohlendioxid (CO 2) Anästhesie. Überqueren Sie diese Jungfrauen auf 2 Tage alten erwachsenen männlichen fliegen tragen die folgenden Genotypen: FH-mCD8GFP (Kontrolle), AuxR 16182 (Aux RNAi) AuxGFP (Aux Überexpression), u…

Representative Results

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von einen automatisierten RING-Test bei der Beurteilung der Fliege negative Geotaxis Verhalten. Im Gegensatz zu den vorherigen RING-Assay, unser Test beinhaltet eine automatisierte Vorrichtung, die eine elektrische Kraft zu fliegen Aktion synchronisiert und analysiert bis zu Hunderte von fliegen gleichzeitig (Abbildung 1). Analyse der Dicer2; DDC > AuxR16182 fliegen zeigten einen altersabhängi…

Discussion

Der automatisierte RING-Test hier beschriebenen ermöglicht gleichzeitig eine Hochdurchsatz-Analyse der Fliege negative Geotaxis Verhalten für Hunderte von fliegen. Bereits bestehende Strategien zur Analyse von Erwachsenen Klettern beinhalten Beobachtungen eine Fliege in einem einzelnen Fläschchen und fliegen Position manuell vom Auge erfasst. Dieses ziemlich langwierige Prozess kann manchmal Fehlinterpretation oder Fehlinterpretation von Daten sowie arbeitsintensiven Arbeit verursachen. Unsere automatisierten RING-Tes…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der Bloomington Stock Center und den Drosophila RNAi in Wien für fliegen Bestände. Das Patent für das RING-Gerät gehört zur Shanghai Advanced Research Institut, chinesische Akademie der Wissenschaften. Anfragen für die RflyDetection-Software auf Fu-de Huang erfolgen soll (siehe Autorenliste). Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Basic Research Program of China (973 Programm 2013CB945602) und National Natural Science Foundation of China (31270825 und 31171043). Wir danken Ho-Lab-Mitglieder zur Diskussion und Kommentare.

Materials

Forma Environmental Chamber Thermo  3949
Carbon dioxide cylinders FuLian GAS Technology GB/T6052
HDR-Camcorder SONY HDR-CX220E
Binocular stereomicroscope Xin Zhen SMZ-168BL
Electronic scales MinQiao SL1002N
Refrigerator Haier SC-350
Agar-agar powder Sinopharm 10000561
Glucose Sinopharm 10010518
Corn meal Sinopharm 5464654
Brown sugar LiuCaiYuan 45467936
Instant dry yeast AB MAURI 20886
AuxR16182 VDRC 7187
UAS-Dicer2 Bloomington 24650
UAS-mCD8GFP Bloomington 32185
DDC-Gal4 A gift from Fude Huang
AuxGFP A gift from Henry Chang

Referencias

  1. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
  2. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
  3. Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
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  10. Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).

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Citar este artículo
Cao, W., Song, L., Cheng, J., Yi, N., Cai, L., Huang, F., Ho, M. An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (127), e56507, doi:10.3791/56507 (2017).

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