Een geautomatiseerde snelle iteratieve negatieve Geotaxis Assay voor het analyseren van volwassen klimmen gedrag in een Drosophila Model van neurodegeneratie
Summary
Dit stapsgewijze protocol analyseert Drosophila negatieve geotaxis gedrag met behulp van een geautomatiseerd systeem van meerdere cilinders die honderden vliegen en synchroniseert hun optreden door een elektromotor. Bij synchronisatie, is vliegen negatieve geotaxis gedrag vehiculumcontrolegroep, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van de zelf ontworpen RflyDetection software.
Abstract
Neurodegeneratieve aandoeningen worden vaak geassocieerd met een progressief verlies van beweging vermogen, verminderde levensduur en leeftijd-afhankelijke neurodegeneratie. Om te begrijpen van het mechanisme van deze cellulaire gebeurtenissen en hun causale relaties met elkaar, Drosophila melanogaster, met zijn verfijnde genetische tools en diverse gedrags functies, worden gebruikt als ziekte modellen voor de beoordeling van neurodegeneratieve fenotypen. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor het analyseren van Drosophila volwassen negatieve geotaxis gedrag, als indicatie voor de mogelijke motor gebreken neurodegeneratie is gekoppeld. Een geautomatiseerde machine is ontworpen en ontwikkeld tot vliegen synchronisatie station met behulp van een eerste elektrische impuls, waardoor later de opname van negatieve geotaxis gedrag in een loop van seconden tot minuten. Beelden van de video-digitaal opnamen worden vervolgens verwerkt met de zelf ontworpen RflyDetection software om statistische gegevens te manipuleren. Anders dan de bepaling van de handmatig gecontroleerde negatieve geotaxis op basis van één vliegen, dit nauwkeurige, snelle en hoge-doorvoer protocol staat data-acquisitie van meer dan honderden vliegen tegelijk, bieden een efficiënte aanpak om vooraf onze inzicht in het onderliggende mechanisme van motorische tekorten neurodegeneratie is gekoppeld.
Introduction
Een scala aan protocollen en methoden zijn ontwikkeld voor het analyseren van Drosophila volwassen klimmen gedrag. Nogal moeizaam, de traditionele analyse meestal gaat brengen van een interne vlieg in een individuele flesje en maakt gebruik van een handmatige kracht te vliegen naar beneden boren voor synchronisatie1,2,3,4. Het is vervelend en tijdrovend, ongeschikt voor grote high-throughput studies, en mogelijke variaties van de handmatige kracht gebruikt om de kraan naar beneden de vliegen evenals andere beperkingen heeft. Ter verbetering van de bepaling, werd een snelle iteratieve negatieve Geotaxis (RING) test ontwikkeld waardoor high-throughput analyse over talrijke vliegen op de dezelfde tijd5. De bepaling vereist echter nog steeds een handmatig om kracht te synchroniseren vliegen actie. Onze versie van de RING assay, herzien op de vorige assay, bevat een metalen base hosting meerdere vliegen-bevattende flesjes automatisch gecontroleerd door een elektromotor om te vliegen synchronisatie6rijden. Bij opname, de vlieg klimmen onmiddellijk na de synchronisatie is geregistreerd dan geanalyseerd met behulp van een zelf ontworpen software. Onze geautomatiseerde RING assay heeft geëlimineerd de vervelende en arbeidsintensieve proces in het verzamelen van gegevens uit een enkele fly, een tegelijk, en de data-acquisitie proces efficiënter ingeschakeld. Daarnaast is de geautomatiseerde RING assay werkzaam zijn in een aantal studies het ophelderen van het mechanisme onderliggende ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson’s, het valideren van de aanpak met hoog rendement7,8,9 .
In dit artikel tonen we de geautomatiseerde RING bepaling met behulp van de DDC-Gal4 gedreven RNAi vliegen. DDC-Gal4 is een Gal4 lijn speciaal uiten in Dopaminerge (DA) en serotonerge neuronen, aldus vertegenwoordigt een geweldig hulpmiddel voor het analyseren van de doel-gen effecten geassocieerd met motorische tekorten begeleidende neurodegeneratie10. Daarnaast nemen we UAS-Dicer2, een vlieg lijn die RNAi efficiëntie verbetert, voor het genereren van de UAS-Dicer2; DDC-Gal4 gereedschap lijn. Het RNAi vliegen we kiezen om te gebruiken is de auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), een gen die wij hebben eerder aangeduid als u wilt vertonen een effect op motorische activiteit8vliegen. auxGFP vliegen zijn ook bereid voor het analyseren van de gevolgen voor de aux overexpressie. We zullen laten zien hoe met de automatische bepaling van de RING te meten vliegen negatieve geotaxis, de resultaten presenteren en bespreken eventuele consequenties van de resultaten verkregen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De geautomatiseerde RING test hier beschreven maakt een analyse van de high-throughput van vliegen negatieve geotaxis gedrag voor honderden vliegen gelijktijdig. Eerder bestaande strategieën voor het analyseren van volwassen klimmen opmerkingen van een enkele vliegen in een individuele flesje betrekken en vliegen positie handmatig wordt gedetecteerd met het blote oog. Deze nogal vervelend proces kan soms verkeerd lezen of verkeerde interpretatie van gegevens, alsook arbeidsintensief werk. Onze geautomatiseerde RING test…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de Bloomington voorraad Center en de Vienna Drosophila RNAi Center voor vliegen voorraden. Het octrooi voor het RING-apparaat behoort tot Shanghai Advanced Research institute, Chinese Academie van Wetenschappen. Aanvragen voor de RflyDetection-software moet worden gedaan om Fu-de Huang (Zie Auteur lijst). Dit werk werd gesteund door subsidies van nationale Basic Research programma van China (973 programma 2013CB945602) en nationale Natural Science Foundation van China (31270825 en 31171043). Wij danken Ho lab leden voor discussie en commentaar.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
Referencias
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer’s Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson’s Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
