Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological
Summary
Este informe describe un enfoque simple para inducir con éxito neuritis autoinmune experimental (EAN) utilizando la mielina proteína cero (P0)180-199 péptido en combinación con adyuvante completo de Freund y toxina del pertussis. Presentamos un paradigma sofisticado capaz de evaluar con precisión la magnitud de los déficits funcionales y neuropatología que ocurren en este EAN.
Abstract
Neuritis autoinmune experimental (EAN) es un bien apreciado modelo experimental de enfermedades desmielinizantes periféricas autoinmunes. Enfermedad EAN es inducida por inmunizar a ratones con péptidos neurogénicas para dirigir un ataque inflamatorio hacia los componentes del sistema nervioso periférico (PNS). Los avances recientes han permitido la inducción de la EAN en la línea de ratón C57BL/6 relativamente resistente utilizando mielina proteína cero (P0)106-125 o P0180-199 péptidos entregados en adyuvante combinada con la inyección de la Toxina pertussis. La capacidad de inducir la EAN en la cepa C57BL/6 permite el uso de las herramientas genéticas numerosos que existen en este fondo de ratón y permite así el sofisticado estudio de patogénesis de la enfermedad y el interrogatorio de la acción mecanicista de la nueva terapéutica en combinación con los enfoques de transgénicos. En este estudio, demostramos un enfoque simple para inducir con éxito EAN con el péptido de180-199 P0 en ratones C57BL/6. También describiremos un protocolo para la evaluación de los déficits funcionales que se producen en este modelo, acompañado por una serie de características de neuropathological. Así, este modelo es un potente modelo experimental para estudiar la patogenesia de neuropatías desmielinizantes periféricas humanas y determinar la eficacia de terapias potenciales que pretenden promover la reparación de la mielina y proteger contra el daño del nervio en autoinmune neuritis.
Introduction
Neuropatías periféricas pueden ser genéticas en origen o adquirida, con neuropatías adquiridas teniendo ya sea metabólica, isquémico, precipitados inflamatorios o tóxicos. Estas enfermedades se clasifican también provechosamente como axonal o demyelinative en origen. El más común adquirida desmielinizante Neuropatías periféricas son la polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda (AIDP, también conocido como síndrome de Guillain-Barré, SGB) e inflamatoria desmielinizante polineuropatía crónica (CIDP)1, 2 , 3 , 4; ambos pathogenetically se caracterizan por una reacción autoinmune dirigida contra la mielina, provocando desmielinización de los nervios periféricos. En estas enfermedades, las células T activadas atraviesan la barrera del nervio y generan una reacción inmune en el PNS. Activación de los macrófagos dentro del nervio entonces causa desmielinización directamente a través de ataque fagocítico o indirectamente a través de mediadores inflamatorios secretados, dando por resultado clínicos incapacidades como parálisis y disfunción sensorial5. Mientras que los axones demyelinated conservan la capacidad de ser remyelinated después de desmielinización, remielinización se retrasa a menudo o incompleta, dando por resultado susceptibilidad de los axones desnudos a daño irreversible, que es la causa principal de la clínica permanente discapacidad. En la actualidad, los tratamientos más eficaces son inmunomoduladores, pero a pesar de su eficacia, en muchos casos la recuperación es a menudo lento y ~ 25% de los pacientes experimentarán déficits funcionales residuales que reducen significativamente su calidad de vida6, 7.
EAN es un modelo animal ampliamente utilizado de demyelinating de neuropatía periférica que ha proporcionado información valiosa en la patogenesia y a fin de evaluar nuevos agentes terapéuticos4. Este modelo puede ser inducido en diferentes especies tales como conejos, ratas, ratones y conejillos de Indias y es inducida por la vacunación con antígenos neurogénicas. Sin embargo, en última instancia la exitosa inducción EAN depende de una respuesta inmune apropiada para la enfermedad de que se produzca. Teniendo en cuenta las variaciones de la especie (y inter-especies/cepa) en la función inmune, se han desarrollado múltiples combinaciones de antígenos y adyuvantes para inducir con éxito el Código EAN. En términos de herramientas genéticas murinas, C57BL/6 es el más utilizado; sin embargo, el péptido de la proteína P2 tradicional 57-81 (P257-81) que resulta en la enfermedad en el ratón SJL susceptibles cepa8 es incapaz de patogenesia ilícito Conduce a déficits funcionales en la cepa C57BL/6. Afortunadamente, paradigmas de sensibilización mediante el P0106-125 o P0180-199 péptidos, se entregó en adyuvante combinada con la inyección de pertussis toxina puede superar esta barrera, que permiten sofisticadas herramientas genéticas ser utilizados en la modelo murino de EAN.
Aquí, se presenta un método simple para la inducción de la EAN en los ratones C57BL/6. Además, se proporciona un enfoque integral detallado por el cual evaluar los déficits funcionales y neuropathological asociados a la enfermedad. El P0180–199 péptido9 fue elegida preferentemente a la alternativa de P057-81 10. El modelo de199 P0180–se ha descrito para producir signos clínicos menos severos en comparación con la alternativa de P057-81 10y por lo tanto es probable que soportar potencialmente la introducción de perturbaciones genéticas deletéreas, recuperan de procedimientos quirúrgicos (como la implantación de la bomba osmótica) y es favorables a la función de paso de cinta de correr pruebas4. Sin embargo, la cinta de correr pruebas de la función de marcha y protocolos histológicos descritos aquí podrían fácilmente aplicarse al estudiar la enfermedad en una variante de57-81 inducida por P0.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este informe describe un método sencillo para inducir EAN con el péptido de180-199 P0 en ratones C57BL/6, lo que permite la cuantificación de los déficits neuropathological y funcionales claves en ratones inducidos con EAN. Distinto en el protocolo de inducción de EAN se describe aquí es el uso de anestesia mientras se realizan las inyecciones de inmunización. El uso de la anestesia isoflurano mejora en gran medida la capacidad para garantizar que el volumen total de inóculo se inyecta por vía subcut?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG es NHMRC Peter Doherty y compañero de carrera temprana esclerosis múltiple investigación Australia (MSRA). JLF es apoyado por una Beca Postdoctoral de MSRA. Este trabajo fue financiado por el Australian National Health y Consejo de investigación médica (NHMRC) proyecto beca #APP1058647 a JX.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
Referencias
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