Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1
Summary
Anticuerpos neutralizantes de la gripe se correlacionan con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización medir anticuerpos neutralizantes en sueros humanos y se utilizan a menudo para serología humana de influenza. Se describe un ensayo de microneutralización con células MDCK-SIAT1 para medir títulos de anticuerpos neutralizantes a contemporáneos 3C.2a 3C.3a a (H3N2) virus y después de la vacunación contra la influenza o infección.
Abstract
Anticuerpos neutralizantes contra la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe se consideran el principal mecanismo inmunológico que se correlaciona con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización (MN) se utilizan a menudo para medir respuestas de anticuerpos neutralizantes en sueros humanos después de la vacunación contra la influenza o infección. Células de riñón canino Madine Darby (MDCK) son el sustrato de células utilizadas para los ensayos de MN. Sin embargo, circula la influenza a (H3N2) 3C.2a y 3C.3a han adquirido el virus alterado especificidad de unión del receptor. La línea de células MDCK-SIAT1 con fracciones mayor α-2,6 galactosa siálicos en la superficie ha demostrado para proporcionar la mayor infectividad y repeticiones más fieles que las células MDCK convencionales para estos virus a (H3N2) contemporáneos. Aquí, describimos un ensayo de MN con células MDCK-SIAT1 que ha sido optimizado para cuantificar los títulos de anticuerpos neutralizantes a estos virus (H3N2) contemporáneos. En este protocolo, suero inactivado por calor que contiene anticuerpos neutralizantes es primero en serie diluido, luego se incubó con 100 TCID50/de virus de la influenza a (H3N2) para permitir que los anticuerpos en los sueros para enlazar a los virus. Células MDCK-SIAT1 se añade a la mezcla de anticuerpo del virus y se incuba durante 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir a (H3N2) virus infectar las células MDCK-SIAT1. Después de la incubación durante la noche, se fijan las placas y la cantidad de virus en cada bien es cuantificada por un análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) utilizando anti-influenza A anticuerpos monoclonales de nucleoproteína (NP). Título de anticuerpos de neutralización se define como el recíproco de la dilución de suero más alta que proporciona ≥50% de inhibición de la infectividad del virus.
Introduction
Virus de la influenza siguen causan morbilidad y mortalidad en la población cada año. HA es la principal glicoproteína superficial del virus de la gripe. Anticuerpos neutralizantes contra HA son el principal mecanismo inmunológico que se correlaciona con la protección de la gripe infección1,2. Ensayos de hemoaglutinación inhibición (HI) y ensayos de MN son dos métodos ampliamente utilizados para medir las respuestas del anticuerpo en el suero humano después de la infección o la vacunación de la gripe3. El ensayo HI mide inhibición de anticuerpos de la hemoaglutinación virus de glóbulos rojos y es considerado un ensayo de suplente. A diferencia de los HI, el ensayo de MN puede medir directamente los niveles de anticuerpos en sueros humanos que neutralizan la infección por influenza en cultivos celulares. Células MDCK se utilizan a menudo en el aislamiento del virus influenza y ensayos de MN4.
Virus de la gripe sufren constantemente deriva antigénica y cambio, adquisición de mutaciones en proteínas HA que pueden alterar la especificidad de Unión receptor de virus. Desde 2014, nuevos clústeres de H3N2 emergieron y continuaron circulando hasta la temporada actual. La mayoría de estos virus pertenece al grupo genético 3C.2a y 3C.3a basado en el análisis filogenético de las proteínas HA. Muchos de los virus circulantes de la 3C.2a habían reducido la capacidad de hemagglutinate de glóbulos rojos y por lo tanto no pueden ser caracterizados por ensayos de HI5. Ensayos de neutralización deben utilizarse para medir las respuestas de anticuerpos para estos virus que no hemagglutinate6. Además, los estudios han demostrado que estos virus a (H3N2) contemporáneos han alterado propiedades de enlace del receptor en comparación con anteriores a (H3N2) virus y tienden a acumular cultura adaptada mutaciones y polimorfismo cuando pasados en célula en vitro las culturas7,8,9. En comparación con las células MDCK convencionales, MDCK-SIAT1 es una línea de células desarrollada por Matrosovich et al. a través de la transfección estable de células MDCK con cDNA humano α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Esta línea celular expresa cantidades crecientes de α2, moléculas de galactosa 6-siálicos y disminución de α2, moléculas de ácido 3-siálicos que el padre de las células MDCK10. Las células de MDCK-SIAT1 han demostrado para mejorar el nivel de aislamiento de virus a (H3N2) en comparación con las células MDCK11. Recientemente, Lin et al. informó que para recién emergidas 3C.2a y 3C.3a humana a (H3N2) virus de la influenza, más fieles réplicas de virus e infectividad de virus mejor fueron alcanzados cuando los virus eran cultivadas en líneas de células MDCK-SIAT1 en comparación con las células MDCK7. Así, las células de MDCK-SIAT1 son los más adecuadas en MN ensayos para caracterizar las respuestas del anticuerpo a los recientes grupos de virus a (H3N2).
Aquí se describe un ensayo de MN con células MDCK-SIAT1 para medir respuestas del anticuerpo a contemporáneo 3C.2a y 3C.3a a (H3N2) virus en suero humano. Virus cultivados en huevos o en las células pueden usarse en este ensayo. Suero inactivado por calor que contiene anticuerpos neutralizantes es primero en serie diluido, luego se incubó con 100 TCID50/bien de influenza a (H3N2) para permitir que los anticuerpos en los sueros para enlazar con el virus. Células MDCK-SIAT1 se añade a la mezcla de anticuerpo del virus y se incuba durante 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir que el virus a (H3N2) infectar las células MDCK-SIAT1 y replicar. Después de la incubación durante la noche, las placas son fijos y la cantidad de virus en cada pozo es cuantificada por un ELISA utilizando anticuerpos monoclonales de anti-influenza A NP. La detección de NP indica la presencia de infección por el virus y la ausencia de anticuerpos neutralizantes. Título de anticuerpos de neutralización se define como el recíproco de la dilución de suero más alta que proporciona ≥ 50% de inhibición de la infectividad del virus.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo de MN es uno de los principales análisis utilizados para serología influenza para detectar respuestas de anticuerpos después de la infección por influenza o vacunación. Títulos generados a partir de ensayos de MN se utilizan a menudo como el resultado primario de muchos estudios de seroepidemiología de la influenza. Análisis de MN son también ampliamente utilizados para sero diagnóstico y la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna. Se han realizado estudios internacionales inter-laboratorio par…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu y Sra. Ashley Burroughs de la división de Influenza de los CDC para su revisión crítica y la asistencia en la preparación de este manuscrito. Agradecemos al Dr. Adrian Reber de la división de Influenza de los CDC para su asistencia en la preparación de los gráficos de la figura 3. Por último, agradecemos a Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemania para proporcionar las células MDCK-SIAT1.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
Referencias
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