Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши
Summary
Здесь мы описываем протокол для всей горе иммунофлюоресценции и на основе изображений количественные объемный анализ зародышей мыши ранней стадии. Мы представляем этот метод как мощный подход к качественно и количественно оценить сердечных структур во время разработки и предложить, что это может быть широко адаптируемым для других органов и систем.
Abstract
Использование изображений методов, когда-либо продвижения широко способствовала нашей углубление понимания эмбрионального развития. Развитие предимплантационной и Органогенез являются две области исследований, которые значительно выиграли от этих достижений, за высокое качество данных, которые могут быть получены непосредственно от визуализации до имплантации эмбрионов или ex vivo органов. Хотя до имплантации эмбрионов привели данные с особенно высоким пространственным разрешением, более поздних стадиях были менее поддаются трехмерной реконструкции. Получение высококачественных 3D или объемных данных для известных зародышевых структур в сочетании с судьбой сопоставления или генетические линии трассировки позволит обеспечить более всесторонний анализ морфогенетических событий, происходящих во время эмбриогенеза.
Этот протокол описывает целом гора иммунофлюоресценции подход, который позволяет для маркировки, визуализации и количественной оценки прародитель клеточных популяций в пределах развивающихся сердца Полумесяца, ключевая структура формируется во время разработки сердца. Этот подход разработан таким образом, что обе на уровне клеток и тканей информация может быть получена. С помощью конфокальной микроскопии и обработки изображений, этот протокол позволяет для трехмерной пространственной реконструкция сердца Полумесяца, обеспечивая тем самым возможность анализировать локализации и организации населения конкретных прародитель во время этот критический этап развития сердца. Важно отметить, что использование ссылка антител позволяет для последовательных маскировки сердца Полумесяца и последующих количественному определению областей в течение Полумесяца. Этот протокол позволит не только подробный анализ раннего развития сердца, но с адаптации должны быть применимы к большинства органов и систем в братскую для раннего Сомит стадии эмбриона мыши.
Introduction
Изучению органогенеза долго полагалась на наблюдении за морфогенетических события развивающегося эмбриона. Эти исследования часто полагаются на использование флуоресцентных красителей или Репортеры трассировки линии в сочетании с маркировки населения определенных ссылок. 1 путем сравнения относительных позиций этих ярлыков, информацию можно почерпнуть на происхождении, движение или конечной вклад населения интерес. Трансплантация и судьба сопоставления эксперименты использовать морфологический достопримечательности или инъекции красителей в не подвижных линий для определения отправной точкой клетки интереса, которые затем проверяются на вклад развитых эмбрионов. 2 , 3 , 4 , 5 генетические эксперименты линии трассировки используйте ту же концепцию с четко репортер аллелей, которые используются для метки клеточных популяций без экспериментальных манипуляций. Ключ для этих подходов является способность определять, с высоким пространственным разрешением, местах экспериментальных и этикетки ссылку. Эти подходы дали выдающийся прогресс в развитии предимплантационной и explant органогенеза исследований. 6 , 7 , 8 , 9
Развития событий, которые лежат в основе сердца морфогенеза были все хорошо описана в последние годы. 10 одним из главных открытий в этой области исследований является описание ряда прародитель популяций, которые можно выделить выражением уникальных маркеров. 11 эти группы населения включают первого и второго сердца поля (FHF и СВЧ), которые присутствуют в пределах сердца Полумесяца на передней стороне эмбриона на эмбриональных день (E) 8,25 мыши развития. 12 этих групп населения часто рассматриваются через сочетание микроскопия поля, который обеспечивает тканевом уровне информацию и серийный секционирование с помощью иммунофлуоресцентного анализа, который предлагает высокое разрешение сотовой но только двумерные пространственной информации. 13 таким образом, хотя эти исследования значительно расширить наше понимание развития сердца, доступные методы имеют ограниченный в глубине количественный анализ морфогенеза в ходе этих этапов, создавая необходимость подходов для изучения Организация этих групп населения на уровне всего организма.
Последние достижения в области конфокальной микроскопии и анализа 3D изображений позволяют с высоким разрешением и высокой пропускной способности алгоритмической реконструкций клеток и структур на местах с относительной легкостью, проложив тем самым путь для детального изучения комплекса клеточных структур. 14 с увеличением вычислительной мощности и развития большой-управляющий алгоритмов, как необходимо обрабатывать экспоненциальное увеличение размера визуализации наборов данных, анализ может теперь быть полностью автоматизирован. 15 автоматизированный анализ визуализации наборов данных имеет преимущество быть беспристрастной, но это только так надежна, как качество входного набора данных; Это необходимо, то, что лучшие практики используются во время приобретения и предварительной обработки изображений для обеспечения высочайшего качества, объективный анализ. 16 протоколов может быть полностью автоматизирована и общие для воспроизводимости результатов, и алгоритмы, используемые проприетарное программное обеспечение, легко доступны через библиотеки для использования учеными, которые знакомы с современной собственности или открытым исходным кодом средства разработчика. 17
Следующий протокол объясняет необходимые шаги для выполнения такого анализа на одной четко определенной модели органогенез, формирование сердца Полумесяца во время разработки сердца. В частности, этот протокол описывает (1) урожай и вскрыть сердца Полумесяца стадии эмбриона, (2) выполняет всю гору иммунофлюоресценции для справки (Nkx2-5) и экспериментальных маркеры (Foxa2Cre:YFP18,,19), (3) подготовить и изображения эмбрионов, с помощью конфокальной микроскопии и наконец (4) анализа и количественной оценки полученные изображения, используя передовые трехмерных подходов. В то время как сердечная Полумесяца используется в качестве примера здесь, с соответствующей модификации, этот протокол может использоваться для анализа нескольких линий в братскую на ранней стадии эмбрионов Сомит.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол выше описывает стратегию для получения количественных данных изображения высокого качества вся гора иммунофлюоресценции мыши после имплантации эмбрионов. Когда выполняется правильно, 3D объемного данные, полученные через эти шаги можно использовать для сравнительного и меж…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась NIH/NHLBI R56 HL128646 и Mindich детского здоровья и развития института (MCHDI) в ISMMS (для н.д.). Е.б. поддерживается HD075735 T32 стажировки NIH/NIDCR. Сердцевина микроскопии в школе медицины Icahn на горе Синай, который частично поддерживается в Tisch институт рака в Маунт Синай Р30 CA196521 – Рак центр поддержки Грант был проведен анализ микроскопии и изображения.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
Referencias
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
