Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas
Summary
Nós descrevemos um método para quantificar a agregação de misfolded proteínas. Nossos detalhes de protocolo Lentivirus induzida por geração de linha celular estável, imagem latente confocal automatizada e análise de imagens de agregados de proteínas. Como uma aplicação ilustrativa, estudamos o efeito de pequenas moléculas na promoção da SOD1 agregação de maneira tempo e dose-dependente.
Abstract
Esclerose lateral amiotrófica (ela) é uma doença neurodegenerativa fatal que pode ser causada por mutações herdadas no gene codificação cobre-zinco superóxido dismutase 1 (SOD1). A instabilidade estrutural da SOD1 e a detecção de inclusões de SOD1-positivo em pacientes familiar-ALS suporta um potencial papel causal para SOD1 misfolded e/ou agregados em patologia de ALS. Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de um ensaio de baseada em célula projetado para quantificar a dinâmica da agregação de SOD1 em células vivas pelo alto teor de abordagens de triagem. Usando vetores Lentivirus, geramos linha celular estável expressam o tipo selvagem e mutante SOD1 A4V marcados com proteína fluorescente amarela e achei que ambas as proteínas foram expressos no citosol sem qualquer sinal de agregação. Curiosamente, apenas SOD1 A4V expressa estàvel em HEK-293, mas não em linhas de células U2OS ou SH-SY5Y, formaram agregados tratamento inibidor de proteossomo. Mostramos que é possível quantificar a agregação com base na análise de dose-resposta de vários inibidores do Proteassoma e para rastrear agregado-formação cinética por microscopia de lapso de tempo. Nossa abordagem introduz a possibilidade de quantificar o efeito das mutações ALS sobre o papel da SOD1 na formação de agregados, bem como a triagem para pequenas moléculas que impedem a agregação de SOD1 A4V.
Introduction
A agregação de proteínas é um processo biológico pelo qual misfolded grupo de proteínas acima e pode atuar como agentes causadores de doenças neurodegenerativas (amiloidose). Caracterizando a agregação da proteína é essencial compreender o papel dos agregados na disfunção celular, bem como facilitar a descoberta de novos fatores que influenciam o aparecimento da patologia. A visualização de proteínas fluorescência-etiquetadas em células vivas é um método poderoso que pode ajudar no desenvolvimento dos ensaios aplicáveis ao alto teor de triagem (HCS)1,2,3,4.
Esclerose lateral amiotrófica (ela) é considerada uma doença proteopathic causada pela presença de misfolded proteínas com a propensão para agregar e se acumulam nos neurônios motor tanto familiar ALS (fALS) e esporádicos ALS (Vanessa)5,6 . Um subconjunto de ~ 20% dos casos de fALS estão associados com mutações dominantes no gene que codifica a enzima antioxidante citosólica cobre-zinco superóxido dismutase tipo 1 (SOD1)7,8. Foram propostas várias possíveis causas para essa disfunção geneticamente derivada, incluindo alterações na estrutura e função da SOD1 variantes, tais como a estabilidade aberrante, desdobrando-se aumento da taxa e propensão a agregação9, 10. Notavelmente, a única propriedade verificada e potencialmente tóxica compartilhado por ambas as variantes ALS-lig SOD1 e selvagem-tipo (WT) SOD1 é uma maior propensão para formar agregados de proteína compartimentada ou inclusões proteicas11,12 . Misfolded mutante SOD1, persistentemente é polyubiquitinated e degradados pelo sistema ubiquitina-Proteassoma. Como resultado, um baixo nível de inibição da atividade do proteossomo leva ao acúmulo de mutante que SOD1 agrega13,14, quais estruturas de forma amorfa composta de componentes solúveis que podem trocar com solúvel mutante SOD1 no citosol15. Em particular, SOD1 mutante A4V (alanina no códon 4 mudada para valina) é a mutação mais comum causando o ALS e leva a neurodegeneração rápida com um tempo médio de sobrevivência de menos de 2 anos após o aparecimento de doença16. Bioquimicamente, A4V SOD1 tem uma tendência crescente para monomerizar, agregar e formar poros amiloides; seus agregados pore-como são semelhantes aos poros amiloides de outras formas de mutante ligado a doença, tais como synuclein-α e β-amiloide proteína17. Para estudar a dinâmica da acumulação de SOD1-agregado, métodos para monitoramento solúveis e insolúveis SOD1 formas agregadas continuam a ser desenvolvidos.
Temos mostrado anteriormente, usando a imagem latente da viver-pilha e células HEK-293 transitoriamente transfected com fluorescente com tag proteína SOD1, que mutações associadas ALS prejudicam SOD1 dimerização e agregação11. Embora a expressão transiente sistemas podem fornecer informações úteis sobre o resultado biológico de curto prazo superexpressão do gene, métodos proporcionando integração estável de genes desejados podem ser preferenciais para o desenvolvimento do ensaio. Como tal, vetores de Lentivirus oferecem a capacidade de conferir a expressão do gene a longo prazo e regulamentado em células de mamíferos 18. Neste estudo, enfocamos a geração de linhas de células estáveis transfectadas com recombinante lentivirus rolamento WT e mutante SOD1 marcou com proteína fluorescente amarela (YFP). Usando microscopia da imagem latente de viver-pilha e quantificação automatizada de agregação de SOD1, desencadeada e quantificada eventos de agregação SOD1 mediante inibição da Proteassoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem duas abordagens principais para a geração de linhas de células estáveis. A primeira leva várias semanas e requer seleção transitória do transfection e resistência dos vetores de DNA genômico de plasmídeo integrado. A segunda leva a uma questão de horas através do uso de lentivirus, tornando este protocolo favorável para a efetiva expressão da proteína do alvo em várias linhas de célula com esforço limitado. A viagem-CMV vector19 foi um vetor sustentado de usar, com efici…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um fundo financiado pelo governo coreano (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) e o programa de apoio à pesquisa nacional Fundação da Coreia (NRF) cientista individual (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
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