Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas
Summary
Se describe un método para cuantificar la agregación de proteínas mal plegadas. Nuestros detalles del protocolo lentivirales inducida por generación de línea celular estable, proyección de imagen confocal automatizado y análisis de imágenes de agregados proteicos. Como una aplicación ilustrativa, se estudió el efecto de pequeñas moléculas en la promoción de la agregación de SOD1 en una forma dependiente de dosis y tiempo.
Abstract
Esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa fatal que puede ser causada por mutaciones heredadas en el gene codificación cobre-zinc superóxido dismutasa 1 (SOD1). La inestabilidad estructural del SOD1 y la detección de inclusiones de SOD1-positivo en pacientes de ALS familiar apoyan un posible papel causal de SOD1 mal plegadas o agregados en patología de ALS. En este estudio, describimos el desarrollo de un análisis celular diseñado para cuantificar la dinámica de agregación de SOD1 en células vivas por alto contenido métodos de detección. Uso de vectores lentivirales, generamos líneas estables de la célula expresando salvaje-tipo y del mutante SOD1 A4V etiquetadas con proteína fluorescente amarilla y encontró que ambas proteínas se expresaron en el citosol sin ningún signo de agregación. Curiosamente, sólo SOD1 A4V había expresado estable HEK-293, pero no en líneas celulares U2OS o SH-SY5Y, agregados al tratamiento del inhibidor de proteasoma. Nos muestran que es posible cuantificar la agregación basada en análisis de dosis respuesta de diferentes inhibidores de la proteasoma y seguimiento de la cinética de la formación de agregados por microscopia Time-lapse. Nuestro enfoque presenta la posibilidad de cuantificar el efecto de mutaciones de la ALS en el papel de SOD1 en la formación de agregados, así como la detección de pequeñas moléculas que impiden la agregación de SOD1 A4V.
Introduction
Agregación de proteínas es un proceso biológico por el cual mal grupo de proteínas para arriba y puede actuar como agentes causales de enfermedades neurodegenerativas (amiloidosis). Caracterización de la agregación de la proteína es esencial para entender el papel de los agregados en la disfunción celular, así como en facilitar el descubrimiento de nuevos factores que influyen en la aparición de la patología. La visualización de proteínas etiquetadas de fluorescencia en células vivas es un método eficaz que puede ayudar en el desarrollo de análisis aplicables al alto contenido de proyección (HCS)1,2,3,4.
Esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es considerada como una enfermedad proteopathic causada por la presencia de proteínas mal plegadas con la propensión a agregado y se acumulan en las neuronas motoras en ALS familiar (fALS) y esporádicos ALS (sALS)5,6 . Un subconjunto de ~ 20% de los casos de fALS se asocian con mutaciones dominantes en el gen que codifica la enzima citosólica antioxidante cobre-zinc superóxido dismutasa tipo 1 (SOD1)7,8. Se han propuesto varias causas posibles para este trastorno genético derivado, incluyendo los cambios en la estructura y función de las variantes de la SOD1, como aberrante estabilidad, mayor tasa de despliegue y propensión a agregado9, 10. En particular, la única propiedad comprobada y potencialmente tóxica compartidos por ambas variantes vinculada ALS SOD1 y wild-type (WT) SOD1 es una propensión creciente para formar agregados proteicos compartimentado o inclusiones proteínico11,12 . Mal plegada mutante SOD1, es persistentemente polyubiquitinated y degradada por el sistema ubiquitina-proteasoma. Como resultado, un bajo nivel de inhibición del proteasoma actividad conduce a la acumulación del mutante que SOD1 agregados13,14, que las estructuras de forma amorfa compuesta de componentes solubles que pueden intercambiar con soluble mutante SOD1 en el citosol15. En particular, SOD1 mutante A4V (alanina en el codón 4 cambiada a valina) es la mutación más común que causa la ALS y lleva a la neurodegeneración rápida con un tiempo promedio de supervivencia de menos de 2 años después del inicio de la enfermedad16. Bioquímico, SOD1 A4V tiene una tendencia creciente a monomerize, se agregan y forman poros de amiloides; sus poro-como los agregados son similares a los poros de amiloides de otras formas mutantes ligado a la enfermedad, como la α-sinucleína y β-amiloide proteína17. Para estudiar la dinámica de la acumulación de agregados de SOD1, métodos de control solubles e insolubles SOD1 agregadas formas permanecen para ser desarrollado.
Hemos demostrado anteriormente, usando proyección de imagen de células vivas y las células HEK-293 transfectadas transitoriamente con SOD1 de etiquetado proteína fluorescente, que mutaciones asociadas a ALS deterioran SOD1 dimerización y agregación11. Aunque la expresión transitoria de sistemas pueden proporcionar información útil sobre el resultado biológico de sobreexpresión génica a corto plazo, métodos proporciona la integración estable de los genes deseados pueden ser preferidos para el desarrollo del ensayo. Como tal, vectores lentivirales ofrecen la posibilidad de conferir la expresión del gen regulado y a largo plazo en las células mamíferas 18. En este estudio, nos hemos centrado en la generación de líneas celulares estables de transduced con lentivirus recombinante teniendo peso y mutante SOD1 etiquetadas con proteína fluorescente amarilla (YFP). Usando microscopía de imágenes de células vivas y cuantificación automatizada de la agregación de SOD1, desencadenaron y cuantificar eventos de agregación de SOD1 en la inhibición del proteasoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay dos enfoques principales para la generación de líneas celulares estables. La primera toma varias semanas y requiere transitoria selección de transfección y resistencia de los vectores de DNA de plásmido integrada genomic. El segundo lleva pocas horas mediante el uso de lentivirus, haciendo este protocolo favorable a la expresión efectiva de la proteína diana en múltiples líneas celulares con un esfuerzo limitado. El viaje-CMV vector19 era un vector constante a utilizar, con eficacia d…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca financiada por el gobierno coreano (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) y el programa de apoyo nacional investigación Fundación de Corea (NRF) científico individual (NRF/NRF-2013M3A9B5076486-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Referencias
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington’s disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer’s disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?. J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a., et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
