Развитие анализа высокое содержание количественной оценки совокупных формирования Sod1 Мутантный белок в живых клетках
Summary
Мы описываем метод количественного определения агрегации смятых протеинов. Наши детали протокола лентивирусные индуцированной стабильной клеток линии поколение, автоматизированных конфокальная томография и анализа изображений белка агрегатов. Как наглядные приложения мы изучали влияние малых молекул в продвижении SOD1 агрегата в зависимости от времени и дозы.
Abstract
Боковой амиотрофический склероз (ALS) является смертельным нейродегенеративных заболеваний, которые могут быть вызваны унаследованные мутации в гене кодирования медно цинковой супероксиддисмутаза 1 (SOD1). Структурная нестабильность SOD1 и обнаружение включений SOD1-позитивных больных семейная ALS поддерживает потенциальных причинную роль Протеолиз и/или агрегированных SOD1 ALS патологии. В этом исследовании мы описывают развитие на основе ячеек пробирного, разработанный высоким содержанием скрининг подходы для количественного определения динамики SOD1 агрегации в живых клетках. С помощью лентивирусные векторы, мы создали стабильных клеточных линий, выражая одичал типа и мутантов А4в SOD1 отмеченных желтый флуоресцентный белок и обнаружил, что оба белки были выражены в цитозоле без каких-либо признаков агрегации. Интересно только SOD1 А4в стабильно выражена в ГЭС-293, но не в U2OS или SH-SY5Y клеточных линий, сформированы агрегаты на лечение ингибитором протеасом. Мы покажем, что это возможно для количественного определения агрегации, основанные на анализе различных ингибиторов протеасом доза реакция, а также отслеживать агрегат формирование кинетики, покадровой микроскопии. Наш подход предусматривает возможность количественной оценки эффект мутаций ALS на роль SOD1 в совокупных формирования, а также скрининга для малых молекул, которые мешают SOD1 А4в агрегации.
Introduction
Агрегации белков является биологический процесс, в котором денатурации белков группа вверх и может выступать в качестве возбудителей в нейродегенеративных заболеваний (амилоидоз). Характеризующие агрегации белка имеет важное значение в понимании роли агрегатов в клеточных дисфункции, также как и облегчение открытия новых факторов, которые влияют наступления патологии. Визуализация с тегами флуоресценции белков в живых клетках это мощный метод, который может помочь в развитии анализов, применимые к высоким содержанием скрининг (HCS)1,2,3,4.
Боковой амиотрофический склероз (ALS) рассматривается как proteopathic заболевания, вызванные наличием смятых протеинов с склонность к совокупности и накапливаются в двигательных нейронов в семье ALS (Фалс) и спорадические ALS (Салс)5,6 . Подмножество ~ 20% фалс случаев связаны с доминирующим мутации в гене кодирования цитозольной антиоксидантной фермента супероксиддисмутаза медно цинковой типа 17,(SOD1)8. Было предложено несколько возможных причин для этого генетически производных дисфункции, включая изменения в структуре и функции SOD1 вариантов, например аберрантных стабильности, увеличилась скорость развертки и склонность к совокупного9, 10. Примечательно свойство только проверенные и потенциально токсичных разделяют оба варианта связаны ALS SOD1 и SOD1 (WT) одичал тип является увеличение склонности агрегатов разобщенным белка или белковых включений11,12 . Протеолиз мутант SOD1, неизменно является polyubiquitinated и деградируют убиквитин протеасом системой. В результате низкий уровень ингибирование протеасом активности приводит к накоплению мутант, SOD1 объединяет13,14, какие формы аморфные структуры состоят из растворимых компонентов, которые могут обмениваться с растворимых мутант SOD1 в цитозоль15. В частности, SOD1 мутант А4в (аланина в кодон 4 изменено на валин) является наиболее распространенным ALS-вызывая мутации и приводит к быстрой нейродегенеративные с средний выживания время менее 2 лет после начала заболевания16. Биохимически SOD1 А4в имеет склонностях к monomerize, агрегировать и формируют амилоида поры; его поры, как агрегатов аналогичны амилоида поры других заболеваний, связанных мутантных форм, например α-synuclein и β-амилоида белка17. Для изучения динамики накопления SOD1-агрегат, методы мониторинга растворимых и нерастворимых SOD1 статистические формы по-прежнему разрабатываться.
Мы ранее показали, с использованием клеток и клеток ГЭС-293 временно transfected с флуоресцентный протеин тегами SOD1, ALS-связанные мутации ухудшить SOD1 димеризации и агрегации11. Хотя системы переходных выражения может дать полезную информацию о биологических результаты краткосрочных гиперэкспрессия генов, методы, обеспечивая стабильную интеграцию желаемого генов может быть предпочтительным для анализа развития. Таким образом лентивирусные векторы предлагают возможность придать экспрессии генов долгосрочный и регулируемых на клетки млекопитающих 18. В этом исследовании мы сосредоточены на создание стабильных клеточных линий, преобразованы с рекомбинантным человека, учитывая WT и мутант SOD1 отмеченных желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП). Использование изображений микроскопия живой клетки и автоматизированных количественной оценки SOD1 агрегации, мы вызвали и количественно SOD1 агрегации событий на ингибирование протеасом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует два основных подхода для создания стабильных клеточных линий. Первый занимает несколько недель и требует переходных transfection и сопротивления выбор векторов геномной интегрированной плазмида ДНК. Второй занимает всего несколько часов с помощью Лентивирусы, что делает этот п?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантов, финансируемая правительством Кореи (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) и Национальный фонд исследований Кореи (NRF) программы поддержки индивидуальных ученый (СР 2013M3A9B5076486/СР 2015R1D1A1A09057239).
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Referencias
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington’s disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer’s disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?. J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a., et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
