活细胞 Sod1 突变蛋白聚集物高含量定量测定方法的建立
Summary
我们描述一种方法来量化错误蛋白质的聚集。我们的协议细节慢诱导稳定细胞线生成, 自动共焦成像, 和图像分析的蛋白质集料。作为一个说明性应用, 我们研究了小分子在促进 SOD1 聚集的时间和剂量依赖性的方式的影响。
Abstract
肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 是一种致命的神经退行性疾病, 可导致遗传突变的基因编码铜锌超氧化物歧化酶 1 (SOD1)。SOD1 的结构不稳定性和家族性 als 患者的 SOD1-positive 包裹体的检测支持错误和/或聚合 SOD1 在 als 病理中的潜在因果作用。在这项研究中, 我们描述了一个细胞分析的发展, 旨在量化的动态 SOD1 聚集在活体细胞的高含量的筛选方法。利用慢向量, 我们生成了表达野生型和突变 A4V SOD1 标记的稳定细胞系, 黄色荧光蛋白, 发现这两种蛋白质都表达了胞没有任何聚集的迹象。有趣的是, 只有 SOD1 A4V 稳定表达在 HEK-293, 但不是在 U2OS 或 SH-SY5Y 细胞线, 形成了聚集后, 蛋白酶体抑制剂治疗。我们表明, 这是可能的量化聚合的基础上, 剂量反应分析的各种蛋白酶体抑制剂, 并跟踪集料形成动力学的延时显微镜。我们的方法引入了定量的可能性, ALS 突变的作用, SOD1 在聚合形成和筛选的小分子, 防止 SOD1 A4V 聚集。
Introduction
蛋白质聚集是一种生物过程, 错误蛋白可以在神经退行性疾病 (淀粉样变性) 中起到致病剂的作用。在理解细胞功能障碍中聚合体的作用, 以及在促进发现影响病理发病的新因素方面, 蛋白质聚集性是必不可少的。活体细胞荧光标记蛋白的可视化是一种强有力的方法, 可以帮助开发适用于高含量筛选 (HCS)1、2、3、4的测试。
肌萎缩侧索硬化 (als) 被认为是一种 proteopathic 的疾病, 由存在的错误蛋白的倾向聚集和积累在运动神经元的家族 als (fALS) 和零星 als (销售)5,6.20% fALS 病例的一个子集与胞浆抗氧化酶铜锌超氧化物歧化因子 1 (SOD1)7,8的基因编码中的显性突变相关。提出了这一基因衍生性功能障碍的几个潜在原因, 包括 SOD1 变种的结构和功能的变化, 如异常稳定性, 增加的展开率, 和倾向于聚合9, 10。值得注意的是, 由 ALS 连接的 SOD1 变种和野生型 (重量) SOD1 所共享的唯一经过验证和潜在毒性的属性是形成条块分割的蛋白质聚合体或蛋白质夹杂物的倾向11,12.错误突变 SOD1, 是持续 polyubiquitinated 和退化的泛素-蛋白酶体系统。因此, 对蛋白酶体活性的抑制导致了突变体 SOD1 聚集13,14, 形成了由可溶性组分组成的无定形结构, 可与可溶性突变体 SOD1 交换。在胞15中。特别是, SOD1 突变 A4V (丙氨酸在密码子4改为缬氨酸) 是最常见的 ALS 引起的突变, 并导致快速神经的平均生存时间少于2年后疾病发作16。生化, SOD1 A4V 有增加的倾向 monomerize, 聚合, 并形成淀粉样孔隙;它的孔状聚合体类似于其他与疾病相关的突变体的淀粉样孔, 如α-核和β-淀粉样蛋白17。为了研究 SOD1-aggregate 积累的动力学规律, 对可溶性和不溶性 SOD1 聚合形式的监测方法有待发展。
我们以前已经显示, 使用活细胞成像和 HEK-293 细胞瞬时转染荧光蛋白标记 SOD1, ALS 相关的突变损害 SOD1 二和聚集11。虽然瞬态表达系统可以提供有关短期基因过度过度的生物学结果的有用信息, 但提供所需基因的稳定整合的方法可能更适合于检测的发展。因此, 慢载体提供了赋予哺乳动物细胞长期和调控基因表达的能力18。在这项研究中, 我们的重点是生成稳定细胞系转与重组慢轴承和突变 SOD1 标记的黄色荧光蛋白 (YFP)。使用活细胞成像显微镜和自动定量的 SOD1 聚集, 我们触发和量化 SOD1 聚集事件时抑制蛋白酶体。
Protocol
Representative Results
Discussion
有两种主要的方法来生成稳定的细胞系。第一次需要几个星期, 需要对基因组整合的质粒 DNA 载体进行瞬时转染和抗性选择。第二个需要几个小时的时间, 通过使用慢, 使这一协议的有效表达的目标蛋白在多个细胞系有限的努力。行程-CMV 矢量19是一个持续使用的载体, 具有保守的转导效率和稳定的转基因表达。令我们吃惊的是, 生成的三单元格线显示的是突变 SOD1 的可见聚合, 而不?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了由韩国政府 (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) 和韩国国家研究基金会 (NRF) 个人科学家支持计划 (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239) 资助的赠款。
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
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