Svært ren innbyggere megakaryocytes kan fås fra ledningen blod-avledet CD34+ celler. En metode for CD34+ celle isolasjon og megakaryocyte differensiering er beskrevet her.
Blodplater produksjon forekommer hovedsakelig i benmargen i en prosess kjent som thrombopoiesis. Under thrombopoiesis skille blodkreft stamfar celler til skjemaet Platederivert forløpere kalt megakaryocytes, som uhelbredelig skiller for å løslate blodplater fra lenge cytoplasmatiske prosesser kalt proplatelets. Megakaryocytes er sjeldne celler begrenset til benmargen og er derfor vanskelig å høste i tilstrekkelig antall til laboratoriebruk. Effektiv produksjon av menneskelig megakaryocytes kan bli oppnådd i vitro ved dyrking CD34+ celler i riktig forhold. Protokollen detaljert her beskriver isolering av CD34+ celler av magnetiske celle sortering fra navlestreng blodprøver. De nødvendige skritt for å produsere svært ren, moden megakaryocytes under serum-free forhold er beskrevet. Detaljer om fenotypiske analyse av megakaryocyte differensiering og besluttsomhet for proplatelet formasjon og blodplater tilbys også. Effektor som påvirker megakaryocyte differensiering og/eller proplatelet formasjonen, som anti-Platederivert antistoffer eller thrombopoietin mimetics, kan legges til kulturperler celler å undersøke biologisk funksjon.
Isolering av tilstrekkelig antall primære menneskelig megakaryocytes (MK) til vanlige laboratoriebruk er ikke gjennomførbart på grunn av deres lave frekvenser i benmargen, der de utgjør ~0.01% celler kjerne1. Et praktisk alternativ er ex vivo ekspansjon og differensiering av blodkreft stilk og progenitor celler i nærvær av bestemte vekstfaktorer. En rekke cytokiner inkludert stamcelleforskningen faktor (SCF, c-kit ligand) og interleukin (IL) -3 og IL-11 har vært er ansatt i kultur systemer å produsere MKs. Thrombopoietin (TPO) den mest effektive vekst og differensiering faktoren for megakaryocytic kulturer og er effektive alene eller sammen med andre cytokiner, slik som SCF og IL-3-2. TPO kan fungere på stammen celle populasjoner føre både spredning og modning av MKs2.
MK produsere blodplater fra cytoplasmatiske utstikkende deler kalt proplatelets og, i vivo, . ca 1 x 1011 blodplater er er dannet daglig for å opprettholde Platederivert tellinger av 150-400 x 109/l. Platederivert produksjon i vitro opptil 1000 -Brett lavere enn den i vivo estimerer3, og dette har gitt opphav til mange kultur vilkår bruker CD34+ blodkreft stamfar celler å forbedre MK og blodplater produksjon i vitro. Den opprinnelige kilden til CD34+ celler brukes for MK differensiering var menneskelig perifert blod4. Cellen kilder andre benmarg5,6, embryonale stamceller/indusert pluripotent stamceller (ESC/iPSC)7og navlestreng blod (UCB)8,9,10 . Human benmarg CD34+ 11 og mus avstamning negative benmarg celler5 produsere MK og blodplater i vitro; Likevel er mangelen på tilgjengelighet for human benmarg begrenser bruken som en kilde til CD34+ celler. Derimot representerer ESC og iPSC en ubegrenset kilde av celler for i vitro Platederivert produksjon. Blodplater produksjon fra disse cellene krever mater celler som murine OP9 celler og lengre kultur perioder. Blodplater-avledet mater-gratis forhold synes å være mindre funksjonelle12. iPSC-avledet blodplater er sannsynlig å være av bruk i klinisk siden de kan utvides til stor skala. Denne prosessen krever lentiviral-mediert signaltransduksjon transkripsjonsfaktorer og langsiktig celle kultur13.
UCB er et tilgjengelig CD34+ celler som lett kan brukes i forskning innstillingene. TPO alene kan fremme differensiering av ledningen blod-avledet CD34+ celler, og dette gir opphav til svært ren, moden MKs uten behov for serum kosttilskudd eller co kultur med mater celler. Andre cytokiner som SCF kan redusere differensiering fra UCB CD34+ celler, mens Flt-3 ligand og IL-11 fremme produksjon av umodne megakaryocytes14. Denne protokollen beskriver produksjon av svært ren MK kulturer fra ledningen blod CD34+ celler i serum-free forhold.
Protokollen beskrevet her er egnet for konsekvent produksjon av MK og blodplater i kultur fra navlestrengsblod. Disse cellene kan brukes å studere ulike prosesser som effekten av legemidler eller biologiske aktiviteter på MK spredning, differensiering, proplatelet formasjon og blodplater produksjon.
En rekke kultur medier og cytokin kombinasjoner har blitt presentert i litteraturen. Tillegg av cytokiner som stilk cellen faktor, Flt-3 ligand, IL-3 og IL-6 støtter CD34+ celle spred…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter støtte av australske Health and Medical Research Council (prosjekt stipend 1012409 koblet til BHC).
Cell Culture Reagents | |||
Recombinant Human TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Serum-free media for CD34+ cells |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CD34 Isolation Reagents | |||
CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | This kit includes the FcR human IgG blocking reagent and CD34 microbeads. These beads contain the anti-CD34 antibody clone QBEND/10. Use a different anti-CD34 clone for purity check (e.g. clone 8G12). |
Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Lymphocyte separation media (density 1.077 g/mL) |
Sterile separation buffer (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | This buffer contains phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 containing 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA. It can be prepared using sterile, cell culture grade components. De-gas before use because air bubbles can block the column. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. This can be used for CD34 purity check. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
PerCP mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 347464 | 1:10 dilution |
PerCP isotype control | BD Biosciences | 349044 | 1:10 dilution |
FITC Mouse anti-Human CD41a | BD Biosciences | 340929 | Final antibody concentration 1:5 dilution. |
APC Mouse anti-Human CD42b | BD Biosciences | 551061 | This antibody can also be used to detect mature MK (the percentage of positive cells in usually lower than with anti CD42a). Final antibody concentration 1:10 dilution. |
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Currently distributed by Bio-Rad. Final antibody concentration 1:10 dilution. |
Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | Currently distributed by Bio-Rad. Isotype control antibody |
Anti von Willebrand factor rabbit polyclonal | Abcam | AB6994 | 1:200 dilution |
V450 mouse anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 dilution |
V450 isotype control | BD Biosciences | 580373 | 1:20 dilution |
PAC1-FITC antibody | BD Biosciences | 340507 | 1:10 dilution |
Anti CD62p mouse monoclonal | Abcam | AB6632 | 1:200 dilution |
Alexa Fluor 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 dilution |
Alexa Fluor 594 goat anti mouse IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 dilution |
Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Isotype control antibody |
Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
CountBright Absolute Counting Beads | Molecular Probes, Invitrogen | C36950 | Counting beads |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Smaller and larger columns are also commercially available |
MidiMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Falcon 5mL round bottom polypropylene FACS tubes, with Snap Cap, Sterile | In Vitro technologies | 352063 | |
Glass slides | Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Inverted microscope | Leica | DMIRB inverted microscope | |
Fluorescent microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
Cell analyser | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Cytospin centrifuge | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Cell analyser software | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
Single cell analysis software | Tree Star | FlowJo | |
Fluorescent microscope software | Zeiss | Zen 2 blue edition |