用反褶积显微镜观察小鼠原发性下丘脑神经元 GLUT4 蛋白的动态图像

台北医科大学动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准了所有动物实验的协议和方法 (协议编号: LAC-2013-0278;LAC-2015-0397) 1. 原代神经元培养 准备在文化之前 在文化的前一天, 用聚 d-赖氨酸 (表 1) 来涂上培养皿。对于一个6的好菜, 加入1.5 毫升聚 d-赖氨酸 (0.05 毫克/毫升) 到每一个井。对于活成像, 培养细胞在一个12毫米 x 12 毫米片在一个标准被涂的 6-井板材。 取出/回收聚 d-赖氨酸, 用2毫升 ddH2O 来清洗两次碗碟。 准备手术工具: 一对微解剖剪刀, 弯曲尖钳, 和标准直尖钳。在手术中对手术工具进行消毒, 并在75% 乙醇中保存。 用20毫升洗涤介质 (表 1) 填充 10 cm 培养皿, 并保持冰。 用15毫升洗涤介质填充15毫升的试管, 并将管子放在冰上。 不同脑区的脑组织分离 牺牲16-19 天的老怀孕雌性小鼠与标准的 euthanization 协议, 放置在一个非通风笼鼠, 然后陶醉与 CO2。E15.5 ~ E16.5 胚胎被推荐用于下丘脑神经元培养和 E16.5 ~ E17.5 更适合海马和皮层神经元培养。 用75% 乙醇消毒平台、解剖显微镜和手术工具, 避免污染。 在脐带区域 (暗红色区域、图 1A、1B虚线) 周围剪切, 以便在不损坏幼崽的情况下很容易地隔离它们 (图 1C, 1D)。 用一对剪刀 (图 1E, F) 卸下每个 pup 的头部部分, 然后使用眼睛区域的细尖直钳 (图 1G) 将头部部分固定到位。使用另一条细尖的弯曲钳, 从两侧取出外皮和颅骨, 并将其从前向背方向剥离 (图 1H, 黑色箭头指向方向)。大脑应该被隔离, 不受任何伤害 (图 1I)。注意: 必须保持大脑的完整性, 以确保在隔离大脑的不同区域时的准确性。 保持隔离的大脑在一个干净的培养皿与冰冷的洗涤介质, 以下步骤。 翻转大脑, 保持腹侧向上。下丘脑是大脑中间的圆形结构 (图 1J, 箭头指向下丘脑区域)。用细尖的弯曲钳将下丘脑组织分离。小心地除去脑膜 (有黄红色的颜色)。注意: 完全切除脑膜是避免成纤维细胞污染的关键步骤。 用锋利的镊子抓住嗅叶, 用弯曲钳剥去整个大脑周围的薄脑膜 (图 1K, L)。 海马是一种香蕉状的形状, 嵌在皮层下部。翻转到皮层的下侧, 将海马体从皮层中分离出来, 用弯曲钳 (图 1M, N,和O) 将其拉到一侧。一定要清除脑组织周围所有的脑膜。 当大脑的所有区域都被隔离后, 在钳夹 (步骤 1.1.5) 的帮助下, 在含有冰冷洗涤介质的15毫升管中切下这些组织。注: 脑组织可保存在冰冷的洗涤介质中2-3 小时。 组织消化、电镀和培养 通过将组织包含15毫升管的2-3 次反转, 冲洗组织, 然后保持导管平直, 使组织安定下来 (1-3 分钟)。 使用与真空系统连接的玻璃巴斯德吸管移除上部介质。要清洗组织, 加入15毫升冰冷洗涤介质和倒置管2-3 次。在下一步之前重复洗涤步骤3次。注意: 在使用真空系统去除上部介质时, 要小心底部的组织。 最后洗涤后, 在1毫升吸管的帮助下去除洗涤介质。 用木瓜蛋白酶-胰蛋白酶消化缓冲液孵育组织 (表 1) 在37° c 的水浴中, 7-14 分钟摇动管子, 确保所有的组织都正确地接触到消化缓冲液。注: 孵化时间和消化缓冲液体积可根据组织大小进行调整。对于从6-8 只幼崽中采集的下丘脑组织, 推荐300µL 木瓜蛋白酶-胰蛋白酶消化缓冲液和7分钟孵育时间。更多的组织将需要更多的消化缓冲。 通过添加1体积的胎牛血清中和酶的活性。在室温下摇动试管3-5 次。 把管子放在机架上, 等待1-2 分钟, 使组织安定下来;小心地用1毫升吸管移除上清液。 添加6毫升电镀介质 (表 1) 到试管中, 并吸管的组织上下50次, 用5毫升吸管轻轻 (为 6-井板, 1.5 毫升电镀介质, 每井推荐)。大多数细胞在重复移后会游离成单个细胞。注意: 在执行此步骤时, 尽量避免气泡的形成。大多数实验室使用火烧玻璃牧场吸管, 以游离组织。一个5毫升吸管与一个狭窄的尖端可以是一个很好的替代这一步。 将一根管子放在机架上, 等待1-2 分钟, 让这些矮胖的非离解组织安定下来。将含有离解细胞的上相带到新的管中, 用电镀介质稀释 (5x 体积电镀介质, 每1x 体积的离解细胞。例如, 添加5毫升电镀培养基为1毫升离解细胞)。 使用例计算细胞密度, 并将所需数量的细胞加入到以多聚-d-赖氨酸为涂层的培养板中, 如步骤1.1.1。我们建议 2-4 x 105细胞每井为6井 dish/35 mm 盘推荐用于神经元成像研究。蛋白质收集和分析需要更高的密度。注: 不要添加太多的电镀介质, 1-1. 5 毫升电镀介质在一个 6-好的菜是足够的附件。过量的培养基将延长适当的细胞附着所需的时间。 等待2-3 小时, 在显微镜下检查种子神经元。神经元连接正常时会开始神经炎。 取出电镀介质, 并将2毫升温热洗涤介质 (37 ° c) 放入盘中洗去电镀介质。重复此步骤两次。 将2毫升完整培养基 (表 1) 添加到6井盘中的每个井中。 每3-4 天更换一半培养基。每一次准备完整的培养基。从不同的小鼠脑区培养的神经细胞将有不同的形态学和特征 (图 2)。 2. 脂质体系统将质粒 DNA 转染为原代神经元 注意: 对于神经元转染, 推荐使用无内毒素质粒 dna 纯化试剂盒 (材料表) 进行 dna 制备。另外的乙醇沉淀可以去除过量的溶剂, 提高 DNA 浓度。 以脂质体为基础的 DNA 转染原代神经元。注: 转染时间取决于实验所需的成熟状态。下丘脑神经元转染在 div 7-10 (div, 天体外)。 dna: 脂质体混合物制备: 稀释 GFP-GLUT4 质粒 DNA16 (2 µg) 在含有300µL 低血清培养基的离心管内。在300µL 低血清培养基中, 用2µL 脂质体制备另一离心管, 在室温下孵育5分钟。 将两根管子的内容结合起来, 在室温下孵育20-30 分钟。 从培养皿中去除神经元培养基。在每个井中加入600µL DNA 脂质体混合物并在37° c 下孵育4-6 小时。 4-6 小时后, 除去 DNA 脂质体混合物, 加入2毫升培养基。 荧光信号, 如单独的 gfp 和 GLUT4 蛋白与 gfp 标签 (图 3和图 4) 共轭, 可以在18-72 小时后观察到。 3. 实时图像记录 为实时成像准备单元格 CCR5-下丘脑神经细胞表达绿色荧光蛋白标记葡萄糖转运体 4 (GFP-GLUT4) 在 #1 上. 5 (或0.17mm 厚度) 玻璃片, 已在6井阶梯1.1.1 前涂有聚 d-赖氨酸板. 小心地将片与神经元结合使用镊子, 并小心地将它放在玻璃幻灯片上。 去除多余的介质/液体与微妙的任务抹布。把抹布折两次, 小心地放在片上。轻轻按下抹布不移动片。注意: 不要用力按压玻璃片。这一步的目的是要确保片不移动/漂移在图像采集过程中引起的浮力。 在反褶积显微镜舞台上放置片和滑动, 片朝下, 并妥善保护。此步骤是为了确保幻灯片位置保持不变, 以便用户可以在以后跟踪同一组目标单元格。 用 60 x/1.42 NA 油浸泡物镜观察 CCR5–下丘脑神经元细胞。 用 CCL5 (10 ng/毫升) 或胰岛素 (10 U/毫升) 将所选细胞样品治疗一分钟. 在片边缘添加1.5 µL 稀释的胰岛素。 立即可视化并记录所选的单元格样本。节目录像软件录制30分钟。 反褶积显微镜与分析注: 本协议的这一部分要求使用反褶积显微镜和专门的软件进行分析。 打开成像系统的电源, 允许显微镜阶段正确初始化, 然后打开 LED 光源。 在 60x 1.42 NA 物镜上加入浸入式油 (37 ° c 的活样品的折射率 1.520)。将样品幻灯片放在显微镜上, 片朝向物镜, 并正确地保护滑块。 使用亮场或荧光照明来识别靶细胞。调整焦点, 直到目标细胞能被清晰地观察到。不要将物镜移动到片区域外, 以免出现不必要的划痕。 用 GFP 信号识别绿色荧光蛋白共轭葡萄糖转运体 4 (GFP-GLUT4)。识别所需的目标单元以获取图像。所选的目标单元格位置可以被记住以备将来参考 (图 4)。 在每个目标单元上设置适当的实验参数 (包括像素数、激发波长、传输百分比、曝光时间、叠加厚度、时间间隔和总成像时间)。对于这个实验, 图像像素数被设置为 512 x 512 (它可以设置在 1024 x 1024 的高分辨率) GFP 信号。曝光时间设置在0.025 到0.05 秒之间, 每 5 min. 次要横向 x、y 和 z 调整可以由推荐的软件 (材料表) 控制。 将曝光参数设置为大约2000到3000计数, 以达到最大像素强度。为了使荧光漂白最小化, 尽量减少励磁光传输的百分比, 同时保持曝光时间少于1秒. 对每个额外的荧光通道和每个感兴趣的区域重复这些步骤。 设置每个目标单元格上 Z 堆栈的上限和下限。这可以通过移动显微镜阶段, 直到目标细胞的顶部和底部都有点不集中。用户可以通过设置上下限和下限之间的图像数来调整 Z 轴的分辨率 (可以通过设置每个图像之间的距离来完成)。 图像堆栈积, 后来分析了各自的软件的帮助-速度从尔在这种情况下。