Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi
Summary
Qui presentiamo un protocollo basato su microscopia per imaging ad alta risoluzione e una ricostruzione tridimensionale del mouse unità neurovascolare e barriera emato – encefalica utilizzando sezioni digalleggiante del cervello. Questo metodo consente la visualizzazione, analisi e quantificazione degli organelli intracellulari a BBB.
Abstract
Emato – encefalica (BBB) è un’interfaccia dinamica multicellulare che regola il trasporto delle molecole tra la circolazione e il cervello. Transcitosi attraverso la Bee regola la consegna di ormoni, metaboliti e gli anticorpi terapeutici al parenchima del cervello. Qui, presentiamo un protocollo che unisce immunofluorescenza delle sezioni digalleggiante con scansione laser confocale e analisi delle immagini per visualizzare gli organelli sottocellulari all’interno delle cellule endoteliali a BBB. Combinando questo set di dati con software di analisi di immagine 3D consente la segmentazione semi-automatizzata e quantificazione del volume capillare e superficie, nonché il numero e intensità degli organelli intracellulari a BBB. La rilevazione dell’immunoglobulina endogeno del mouse (IgG) all’interno di vescicole intracellulari e loro quantificazione a BBB viene utilizzata per illustrare il metodo. Questo protocollo può essere applicato potenzialmente all’indagine dei meccanismi di regolazione BBB transcitosi di molecole differenti in vivo.
Introduction
Emato – encefalica (BBB) è una barriera cellulare continua formata da neuroni, astrociti, cellule endoteliali e periciti che separa il sistema nervoso centrale (SNC) dal sangue circolazione1. Il regolamento di trasporto attraverso la Bee svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell’omeostasi del cervello ed è mediato dalla proprietà specializzate delle cellule endoteliali cerebrali (BECs). La presenza di giunzioni intercellulari strette tra BECs e un basso tasso basale di transcitosi limitare il trasporto paracellulare e transcellulare di molecole ematica, rispettivamente2. Recentemente, la via di transcitosi in BECs è stata sfruttata per migliorare la fornitura di grandi molecole terapeutiche al cervello3,4. Tuttavia, i meccanismi di transcitosi attraverso la Bee non sono ancora stati completamente caratterizzato5,6.
Vasto lavoro è stato fatto in vitro per decifrare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il trasporto intracellulare attraverso BECs7,8,9,10, 11, ma tali sistemi non riescono a ricapitolare l’architettura complessa e la fisiologia dell’unità neurovascolare (NVU). D’altra parte, gli studi in vivo12,13 fornire dettagliate informazioni quantitative sui tassi di trasporto attraverso la Bee ma non forniscono le comprensioni nei meccanismi intracellulari di trasporto. Di conseguenza, indagando i componenti cellulari e intracellulari il NVU in vivo ed ex vivo rimane molto impegnativo14. Solo un numero limitato di tecniche è suscettibile di analizzare strutture subcellulari all’interno delle cellule il nvu. Maggior parte degli studi utilizza la microscopia elettronica, ma questa tecnica è limitata dai protocolli complessi necessari per la corretta preparazione e trattamento dei campioni. Quindi, abbiamo stabilito una metodologia basata sulla microscopia confocale ad alta risoluzione che faciliterebbe l’elaborazione dei campioni del cervello, l’analisi e la quantificazione dei compartimenti subcellulari all’interno delle cellule il nvu.
Qui, descriviamo un protocollo che utilizza sezioni digalleggiante di cervello di topo per eseguire imaging quantitativo del BBB e NVU a livello cellulare e subcellulare. Abbiamo testato e approvato un certo numero di anticorpi anti-immagine e ricostruire il NVU in tre dimensioni. Inoltre, questo protocollo permette la formazione immagine la risoluzione ottica massima di diffrazione limitata degli organelli all’interno dei capillari del cervello. Insieme con analisi dell’immagine, questo protocollo consente di indagare il trasporto intracellulare di macromolecole attraverso la Bee in diverse condizioni sperimentali, ad esempio in modelli murini di malattia di neurodegenerazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di cui sopra descrive la preparazione di sezioni digalleggiante del cervello, macchiatura immunofluorescente, acquisizione di immagini e parametri di analisi per microscopia ad alta risoluzione della BBB. Questo metodo è stato recentemente utilizzato per studiare la localizzazione di anticorpo consegna piattaforme3, il trasporto di IgG endogeno attraverso la BBB17e l’eterogeneità della BBB su Pericita perdita18. Diverse fasi del protocollo possono essere modificati per adattarsi all’obiettivo specifico dell’esperimento. In primo luogo, l’uso di sezioni spesse (100 µm) facilita la loro manipolazione durante le procedure di montaggio e di immunostaining. Permette anche per la ricostruzione 3D della rete capillare, l’unità neurovascolare e per la generazione di sezioni trasversali NVU e capillare. Tuttavia, penetrazione di anticorpi all’interno delle sezioni del tessuto può variare e alcuni macchiatura dell’anticorpo può essere limitata allo strato superficiale del tessuto vicino il vetrino coprioggetti. Il protocollo può essere modificato aumentando la concentrazione di detersivo durante il passaggio di permeabilizzazione e/o la lunghezza del passo permeabilizzazione per migliorare la penetrazione dell’anticorpo nel tessuto. In secondo luogo, la qualità dell’immagine può essere compromessa quando si tenta di acquisire immagini più profonde all’interno del tessuto (di solito 20-30 µm sotto la superficie) a causa di dispersione della luce così come aberrazioni ottiche dalla mancata corrispondenza di indice di rifrazione. Per ovviare a questo problema, nuovi metodi per schiarimento del tessuto e dell’anticorpo attivo penetrazione20 possono essere combinati con questo protocollo per grandi volumi di immagini del tessuto. In terzo luogo, deconvoluzione viene eseguita dopo l’acquisizione di immagini per migliorare la risoluzione assiale dell’immagine. La scelta dell’algoritmo di deconvoluzione cieco utilizzato in questo protocollo si basava su (i) la sua facilità d’uso, come richiesto, nessun pre-calcolo della funzione di diffusione del punto (ii) la sua robustezza per il miglioramento della qualità di immagine21e (iii) la mancanza di manufatti su mIgG strutture intracellulari dopo l’implementazione. A seconda delle strutture intracellulari visualizzate nell’esempio, altri algoritmi di deconvoluzione potrebbero causare immagini di qualità superiore. I seguenti riferimenti21,22 forniscono un ampio dibattito sui vantaggi e limitazioni degli ulteriori algoritmi di deconvoluzione di immagine. Infine, l’uso di un pacchetto di software di analisi di immagine ha permesso la segmentazione dei capillari e strutture intracellulari in tre dimensioni. Chiaramente l’analisi dell’immagine non è limitato al software descritto nel protocollo e pacchetti alternativi, ad esempio quelli discussi in riferimento23, può essere utilizzato per immagini del segmento. L’idoneità dei programmi software diversi per l’analisi delle strutture intracellulari attraverso la Bee deve essere verificata empiricamente valutando la precisione di segmentazione di immagini.
Poiché questo metodo si basa su campioni fissati, non fornisce informazioni dirette sulle dinamiche di transcitosi attraverso la Bee. Tuttavia, si può abbinare con esperimenti di tempo-corso24, ad esempio per via endovenosa iniettando la molecola di interesse e misurando il suo accumulo all’interno di BECs in diversi momenti dopo l’iniezione, per ricostruire la cinetica di trasporto intracellulare. Il vantaggio di questo approccio è che permette l’analisi delle regioni profonde del cervello, come mostrato in18, che sono attualmente inaccessibile al videomicroscopia approcci di imaging dal vivo. Un passaggio fondamentale durante il protocollo è l’attento monitoraggio della fissazione del tessuto. Fissaggio con 4% PFA riduce drasticamente l’immunogenicità degli organelli intracellulari e di immunoglobuline endogena o marginalmente amministrato17 (Figura 1B). Una limitazione di questo protocollo è relativo requisito degli anticorpi di alta qualità (cioè, bassa colorazione aspecifica, bassa reattività crociata) adatti a immunofluorescenza. Purché tali reagenti sono disponibili, il metodo può essere applicato per studiare la localizzazione intracellulare di tutta la proteina di interesse. Ad esempio, il protocollo è stato utilizzato per identificare i lisosomi nel cervello cellule endoteliali17. Si deve inoltre osservare che, poiché questo protocollo si basa su microscopia confocal, la risoluzione laterale è limitata dalla diffrazione e non è possibile risolvere strutture più piccoli di circa 175 a 250 nm (Figura 2).
Gli studi precedenti hanno effettuato analisi dettagliata della composizione cellulare dell’unità neurovascolare usando microscopia confocale25,26. Tuttavia, indagando il trasporto intracellulare a BBB si basa principalmente sull’uso di microscopia elettronica di trasmissione19,27,28. Mentre questo metodo offre la massima risoluzione laterale di strutture intracellulari, microscopia elettronica rimane una tecnica impegnativa con bassa velocità effettiva. Inoltre, il numero di bersagli molecolari differenti che possono essere visualizzate da EM è molto limitato. Questo protocollo offre un’alternativa accessibile per studiare il trasporto intracellulare a BBB. La procedura completa, dall’accumulazione del cervello all’analisi di immagine, può essere eseguita in 5 o 6 giorni. Se gli anticorpi adatti sono disponibili, immunofluorescenza consente la rilevazione simultanea di più tipi/molecole delle cellule all’interno del campione stesso. Inoltre questo protocollo potrebbe essere combinato con tecniche di microscopia di Super-risoluzione per superare i limiti nella risoluzione spaziale29. Nel complesso, il protocollo sopra descritto consente la quantificazione dei cambiamenti nella localizzazione intracellulare di proteine di interesse all’interno dell’unità neurovascolare. Sua applicazione per diverse perturbazioni genetiche o farmacologiche permetterà di indagare le funzioni struttura e trasporto intracellulare di BBB in vivo.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.V. lavoro è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato Roche (2014-2017).
Materials
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
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