重叠肽库在蛋白质 Qa-1 表位中的映射
Summary
Qa-1 (HLA) 属于一组经典主要组织相容性复杂的1b 分子。免疫 Qa-1-binding 表位已表明, 以加强组织特异性免疫调节和改善一些自身免疫性疾病。在此, 我们描述一个重叠的肽库策略, 以确定 Qa-1 表位的蛋白质。
Abstract
Qa-1 (HLA E 在人) 属于一组经典主要组织相容性复合体 1b (MHC-Ib) 分子。最近的数据表明, Qa-1 分子在测量细胞的结构和功能完整性, 诱导免疫调节, 并限制免疫应答病毒感染的重要作用。此外, 通过表位免疫功能增强 Qa-1-restricted CD8 的+ T 细胞, 在几种自身免疫性疾病动物模型中显示了治疗效果,例如: 实验过敏脑脊髓炎,胶原诱导的关节炎, 肥胖糖尿病。因此, 迫切需要一种方法, 可以有效和快速地确定功能 Qa-1 表位的蛋白质。在这里, 我们描述一个协议, 利用 Qa-1-restricted CD8+ T 细胞系特定的重叠肽 (OLP) 库, 以确定 Qa-1 表位的蛋白质。这个 OLP 库包含15的重叠多肽, 覆盖了整个蛋白质的长度, 相邻的多肽与11种氨基酸重叠。使用该协议, 我们最近确定了一个 9 Qa-1 表位的髓鞘胶质糖蛋白 (MOG)。这一新映射的 MOG Qa-1 表位被证明是为了诱导特定的抗原, Qa-1-restricted CD8+ T 细胞增强髓鞘特异的免疫调节。因此, 该协议对于将来研究 Qa-1-restricted CD8+ T 单元格的新目标和功能是有用的。
Introduction
Qa-1 属于一组经典主要组织相容性复合体 1b (MHC-Ib) 分子的小鼠。它的人类同源是 HLA E。以前的证据表明 Qa-1 分子具有重要的生物学功能。首先, Qa-1 分子在测量细胞结构和功能完整性方面起着重要作用。在这方面, Qa-1 分子已经进化了一些策略来监测细胞的正常功能。一个这样的策略使 Qa-1 分子能够形成与加工的领导肽 (表位),即Qa-1 行列式修饰 (Qdm), 从经典的 MHC Ia 分子在内质网1处理的复合物。这些 Qa-1/Qdm 配合物随后在细胞表面显示, 并结合 nk 细胞抑制性 NKG2A 受体, 抑制 nk 杀伤活性2。如果 MHC-Ia 分子的表达丢失, 细胞 (如恶性细胞) 就会对 NK 的杀伤2敏感。另一种策略使 Qa-1 分子能够在细胞表面形成新的 Qa-1/epitope 配合物 (与抗原处理相关的运输载体)3和/或 ERAAP (内质网肽相关抗原处理)4 (这两种缺陷经常发生在恶性细胞中)。表达这些新的 Qa-1/epitope 复合体的细胞可以通过表位特异的 Qa-1-restricted CD8+ T 细胞识别和消除。其次, Qa-1 分子诱导免疫调节5。在这方面, Qa-1/epitope 配合物已被证明刺激 CD8+调节 T (t) 细胞, 这是重要的预防免疫介导的损害 self-tissues67,8 ,9,10。第三, Qa-1-restricted CD8+ t 细胞已被证明可以限制免疫应答病毒感染11。
因此, 具体增加表位特定的 Qa-1-restrictred CD8+ T 细胞是一个潜在的可行的策略, 以消除异常细胞, 增强免疫调节, 并为控制的大小病毒诱导的免疫应答。虽然尚未确定是否增加表位特定的 Qa-1-restricted CD8+ T 细胞可以增强免疫监测和限制病毒诱导的免疫应答, 但我们的实验室和其他人已经清楚地表明免疫 Qa-1 表位可增强 Qa-1-restricted CD8 t 细胞特异性自身免疫 CD4 + t 细胞的功能, 从而有效控制 CD4+ t 细胞介导的自身免疫性疾病实验性反应性脑脊髓炎动物模型的多样性 ( 人多发性硬化动物模型 )6,10, 胶原诱导关节炎 ( 人类类风湿关节炎动物模型 )7, 以及肥胖糖尿病 (人类1型糖尿病动物模型)8。此外, 我们发现, 免疫与组织特定的 Qa-1 表位导致特定的控制免疫介导的炎症, 在该组织通过增强 CD8+ t 细胞12。上述临床前研究的成功表明, 需要对 Qa-1 表位免疫进行全面评估, 以治疗组织特异性免疫介导的疾病, 并有可能治疗与自来水缺乏症相关的其他疾病, 并ERAAP
因此, 有一个技术的需求, 可以可靠和快速地分析 Qa-1 表位的蛋白质。在这方面, 描述了数量有限的生物重要的 Qa-1 表位。大多数这些 Qa-1 表位被确定偶然在研究 CD8+ T 细胞对细菌的反应13, 细胞缺乏在 TAP3, 细胞缺陷在 ERAAP4, 和细胞, 导致 EAE6, 9。因此, 一个高吞吐量的技术是可取的, 以确定生物重要的 Qa-1 表位在一个定义的蛋白质。在下面, 我们描述一个重叠的肽 (OLP) 图书馆策略, 映射功能的 Qa-1 表位在一个蛋白质使用 Qa-1-resrticted CD8+ T 细胞系特定的 OLP 池 (OLP_pool) 的蛋白质。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一个用于分析蛋白质中 Qa-1 表位的协议。关于该议定书, 以前还报告了其他一些战略。首先, 异基因 CD8+ T 单元格线和克隆用于标识 Qdm1。其次, 一个假定的 Qa-1-binding 主题从分析 Qdm 用于识别 HSP60p216-224 和 TCRBV8.1 表位9,18。第三, 从蛋白质中单独重叠的肽被用于免疫动物。随后, 从免疫动物中分离出来的 CD8+<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢佩内洛普. 加西亚的技术援助和这份手稿的准备工作。这项工作得到了一项研究创新补助金 (钻机) 从医学院在 PP1685 琳达大学 (681205-2967) 和试点补助金从国家多发性硬化症协会 () XT。
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
Referencias
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
