Rensing av Viral DNA for identifikasjon av tilknyttet Viral og cellulær proteiner
Summary
Målet med denne protokollen er spesielt merke og selektivt isolere virus-DNA fra infiserte celler for karakterisering av viral genomet forbundet proteiner.
Abstract
Målet med denne protokollen er for å isolere herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA fra infiserte celler for identifikasjon av tilknyttet viral og mobilnettet proteiner av masse massespektrometri. Selv om proteiner som samhandler med viral genomer spille viktige roller i å bestemme utfallet av infeksjon, var ikke en omfattende analyse av viral genomet forbundet proteiner tidligere mulig. Her viser vi en metode som gjør direkte rensing av HSV-1 genomer fra infiserte celler. Replikere virus-DNA er selektivt merket med endrede nukleotider som inneholder en alkyne funksjonsgruppe. Merket DNA er deretter spesielt og irreversibelt merket via kovalente feste biotin azide via en kobber (I)-katalysert azide-alkyne cycloaddition eller klikk reaksjon. Biotin-merket DNA er renset på streptavidin-belagt perler og tilhørende proteiner er elut og identifisert av massespektrometri. Denne metoden aktiverer selektiv målretting og isolering av HSV-1 replikering gafler eller hele genomer fra komplekse biologiske miljøer. Videre vil tilpasning av denne tilnærmingen tillate etterforskning av ulike aspekter av herpesviral infeksjon, samt undersøkelse av genomer andre DNA virus.
Introduction
Virus har begrenset kapasitet til å utføre grunnleggende funksjoner og derfor avhengig av vert faktorer for å lette kritiske aspekter av infeksjon inkludert viral genuttrykk, replikering, reparasjon, rekombinasjon og transport. Aktivitetene til disse vert faktorer er ofte forsterket av virally kodet proteiner. Dessuten, må virus unngå deteksjon og forstyrrelser av mobilnettet Svar å virusinfeksjon. Derfor diktere virus vert interaksjoner utfallet av infeksjon. Av avgjørende betydning er å forstå hvordan virus endre mobilnettet miljø for å tilpasse den cellulære maskineriet for å lette viral prosesser. Av spesiell interesse er å identifisere hvilke faktorer og prosesser handle på viral genomer gjennom smittsomme syklusen.
Herpes simplex er virus 1 (HSV-1) en dobbel strandet DNA virus som infiserer en betydelig del av befolkningen. I den første timen av infeksjon inn viral genomet kjernen, der en bestilte kaskade av viral genuttrykk følger sammen med viral replikasjon DNA (vDNA)1. I kjernen, genomer kan epigenetic regulering, gjennomgå reparasjon og rekombinasjon, og er pakket i capsids, slik at de første avkom virions produseres i mindre enn seks timer. Evaluering av viral genomet forbundet proteiner i løpet av infeksjon vil legge grunnlaget å etterforske molekylær detaljer om prosesser som handle på viral genomer og gir innsikt i hvilke viral og cellulære faktorer er involvert i ulike stadier av infeksjon.
Tidligere metoder for etterforskning av vert faktorer involvert i viral infeksjon inkluderer affinitet rensing av virale proteiner for analyse av tilhørende mobilnettet proteiner2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. disse analyser har vært medvirkende til å identifisere cellulære faktorer involvert i vert antiviral svar, samt viral chromatin endring, genekspresjon, og DNA-reparasjon. Det er imidlertid vanskelig å fastslå om interaksjoner, avhengig av tilknytningen vDNA og Proteomikk bare gi innsikt i samhandlinger som oppstår som en funksjon av en bestemt viral faktor. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er brukt til å identifisere hvor spesifikke viral og cellulær proteiner bindes til viral genomer,10,,11,,12,,13,,14 , 15 og fluorescerende i situ hybridisering (fisk) kombinert med immunocytochemistry har aktivert visualisering av cellulære faktorer som colocalize med vDNA16,17,18, 19 , 20. disse analyser tillate romlige og tidsmessige analyse. Imidlertid omfatter begrensninger behovet for svært spesifikke antistoffer, begrenset følsomhet og behovet for forrige innsikt virus vert interaksjoner. Derfor utviklet vi en metode basert på iPOND (isolering av proteiner på begynnende DNA)21 og aniPOND (akselerert innfødt iPOND)22 selektivt etiketten og rense vDNA fra infiserte celler for objektiv identifikasjon av viral genomet tilhørende proteiner av massespektrometri. iPOND har vært instrumentell for etterforskningen av mobilnettet replikering gaffel dynamics.
For selektiv rensing av viral genomer fra infiserte celler, er replikere vDNA merket med ethynyl endret nucleosides, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) eller 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (figur 1), etterfulgt av kovalente Bøyning til biotin azide via Klikk kjemi å lette enkeltsteg rensing av viral genomer og tilhørende proteiner på streptavidin-belagt perler (figur 2B). Viktigere, er infeksjoner gjennomført i stasjonære celler som ikke er engasjert i mobilnettet utryddelse aktivere bestemte merking av vDNA. Videre HSV-1-infeksjon forårsaker celle syklus arrestasjon og hemmer mobilnettet DNA replikering23,24. Virus kan prelabeled før infeksjon for analyse av proteiner forbundet med innkommende viral genomer (figur 1A) eller merket utryddelse for analyse av proteiner tilknyttet nylig syntetisk vDNA (figur 1B) 25. tillegg puls chase analyse kan brukes til å undersøke naturen av proteiner forbundet med viral replikasjon gafler (figur 1 c)26. I tillegg kan ethynyl endret vDNA være covalently konjugert til en fluorophore for romlig undersøkelse av protein dynamics (figur 2A og Figur 3). Bildebehandling tillater direkte visualisering av vDNA er en gratis metode for validering av vDNA-protein interaksjoner og kan tilpasses til å spore viral genomer gjennom infeksjon. Vi forventer at disse kan endres lenger å studere alle aspekter av herpesviral, inkludert ventetid og reaktivering, og å studere andre DNA virus. Videre kan merking med 5-ethynyl uridine (EU) tillate for analyse av RNA viral genomer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen inneholder flere trinn som, hvis ikke den følges nøye, kan resultere i betydelig redusert protein avkastning eller forurensning med cellular DNA. Det er viktig at stasjonære celler brukes for alle eksperimentene slik at mobilnettet DNA ikke er merket og renset. Dette kan bekreftes av fraværet av mobilnettet DNA polymerases i protein utvalget fordi HSV-1 ikke utnytter mobilnettet DNA polymerase for genomet syntese. Under EdC merking og kjerner høsting trinnene, bør prøver være forskjøvet slik at…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner Hannah Fox for hjelp i utarbeidelsen av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH gi R01AI030612.
Materials
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
Referencias
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
