Summary

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

Published: August 31, 2017
doi:

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא במיוחד לתייג באופן סלקטיבי לבודד את ה-DNA הנגיפי של תאים נגועים על האפיון של גנום ויראלי הקשורים חלבונים.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה הוא לבודד את וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) ה-DNA של תאים נגועים לצורך הזיהוי הקשורים ויראלי החלבונים על ידי מסה ספקטרומטר. למרות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם הגנום הנגיפי משחק תפקידים עיקריים בקביעת התוצאה של זיהום, ניתוח מקיף של גנום ויראלי הקשורים חלבונים לא היה אפשרי בעבר. כאן נדגים שיטה המאפשרת את טיהור ישירה של HSV-1 הגנום של תאים נגועים. שכפול ה-DNA הנגיפי מסומן באופן סלקטיבי עם נוקלאוטידים ששונה מכילים קבוצה פונקציונלית של אלקין. דנ א שכותרתו אז במיוחד ובלתי הפיך מתויג באמצעות החזקה קוולנטיות של ביוטין אזיד דרך נחושת (I)-מזורז אזיד-אלקין cycloaddition או לחץ על התגובה. מתויג ביוטין DNA מטוהר על חרוזים מצופים streptavidin, חלבונים הקשורים eluted, המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. שיטה זו מאפשרת מיקוד סלקטיבי ובידוד של מזלגות שכפול HSV-1 או כל הגנום של סביבות ביולוגיות מורכבות. יתר על כן, עיבוד של גישה זו יאפשר החקירה של היבטים שונים של זיהום herpesviral, כמו גם הבחינה של הגנום של וירוסים אחרים, ה-DNA.

Introduction

וירוסים יש קיבולת מוגבלת כדי לבצע פונקציות חיוניות, ולכן תלויות בגורמים המארח כדי להקל על היבטים קריטיים זיהום כולל ביטוי גנים ויראליים, שכפול, תיקון, רקומבינציה תחבורה. הפעילות של גורמים אלה מארח הם לעיתים קרובות בתוספת לשווק מקודד חלבונים. בנוסף, וירוסים עליך להימנע וזיהוי הפרעות על-ידי תגובות הסלולר זיהום ויראלי. לכן, וירוס מחשב מארח אינטראקציות להכתיב את התוצאה של זיהום. חשיבות עליונה היא ההבנה כמה וירוסים לשנות את הסביבה הסלולר, במטרה להתאים את מכונות הסלולר כדי להקל על התהליכים ויראלי. עניין מיוחד הוא זיהוי גורמים ותהליכים אשר פועלים על הגנום הנגיפי במהלך מחזור זיהומיות.

וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) הוא שכפול תקועים וירוס DNA מדביק חלק ניכר של האוכלוסייה האנושית. בתוך שעה הראשונה של זיהום, הגנום הנגיפי נכנס לגרעין, איפה מדורגת מסודרת של ביטוי גנים ויראליים מתפתח בתיאום עם שכפול נגיפי DNA (vDNA)1. בגרעין, הגנום הם כפופים לכללים epigenetic, לעבור רקומבינציה ותיקון, ארוזים לתוך capsids, כך virions הראשון רומא מיוצרים תוך פחות מ-6 שעות. הערכה מקיפה של גנום ויראלי הקשורים חלבונים לאורך כל הקורס של זיהום תניח את הקרקע כדי לחקור את הפרטים מולקולרית של תהליכים פועלים על הגנום הנגיפי, יספק תובנות אילו גורמים נגיפיים וסלולריות מעורבים בשלבים שונים של זיהום.

שיטות קודמות לחקירה של המארח גורמים מעורבים זיהום ויראלי לכלול טיהור זיקה של חלבונים נגיפיים לניתוח של החלבונים הקשורים2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. מבחני אלה סייעו לצורך הזיהוי של הגורמים המעורבים הסלולר מארח תגובות אנטי ויראליים, כמו גם השינוי כרומטין ויראלי, ביטוי גנים, ותיקון דנ א. עם זאת, קשה לאמת אם האינטראקציות תלויים השיוך vDNA ולאחר פרוטאומיקס רק לספק תובנות האינטראקציות המתרחשות כפונקציה של גורם ויראלי ספציפי. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) נעשה שימוש כדי לזהות איפה לאגד חלבונים נגיפיים וסלולריות ספציפיים הגנום הנגיפי10,11,12,13,14 , 15 ופלורסנט היברידיזציה (דגים) בשילוב עם immunocytochemistry אפשרה את הפריט החזותי של גורמים הסלולר colocalize עם vDNA16,17,18, 19 , 20. מבחני אלה מאפשרים יכולות ניתוח. עם זאת, מגבלות כוללים את הצורך של נוגדנים ספציפיים מאוד רגישות מוגבלת, הצורך הקודם תובנה וירוס מחשב מארח אינטראקציות. לכן פיתחנו שיטת עבודה המבוססת על iPOND (בידוד של חלבונים על ה-DNA nascent)21 , aniPOND (iPOND יליד מואצת)22 כדי לתייג באופן סלקטיבי ולטהר vDNA מן נגוע תאים לצורך זיהוי מוטים אפידמיולוגיה חלבונים הקשורים באמצעות ספקטרומטר מסה. iPOND היה אינסטרומנטלי החקירה של דינמיקה מזלג שכפול הסלולר.

לטיהור סלקטיבי של הגנום הנגיפי של תאים נגועים, שכפול vDNA נקראת עם ethynyl ששינה נוקלאוזידים, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (אדו) או 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (איור 1), ואחריו קוולנטיות ההטיה כדי ביוטין אזיד באמצעות לחץ על כימיה כדי להקל על צעד בודד טיהור של הגנום הנגיפי וחלבונים הקשורים על חרוזים מצופים streptavidin (איור 2B). חשוב לציין, זיהומים מבוצעות בתאי נייח, אשר לא עוסקים הסלולר שכפול ה-DNA כדי לאפשר תיוג ספציפית של vDNA. יתר על כן, זיהום HSV-1 גורם מחזור מעצר התא, ומעכב הסלולר DNA שכפול23,24. הוירוס יכול להיות prelabeled לפני זיהום לניתוח של חלבונים הקשורים נכנסות הגנום הנגיפי (איור 1 א’) או תווית במהלך שכפול ה-DNA על הניתוח של חלבונים הקשורים לאחרונה מסונתז vDNA (איור 1B) 25. יתר על כן, ניתוח צ’ייס הדופק יכול לשמש כדי לחקור את הטבע של חלבונים הקשורים שכפול ויראלי מזלגות (איור 1C)26. בנוסף, vDNA ethynyl-השתנה יכול מצומדת covalently כדי fluorophore לחקירה המרחבי של חלבון דינמיקה (2A איור , איור 3). הדמיה מאפשר פריט חזותי ישיר של vDNA היא גישה ללא תשלום עבור האימות של אינטראקציות חלבון vDNA, ניתן להתאים לאתר הגנום הנגיפי במהלך זיהום. אנו צופים כי הגישות האלה יכול להיות עוד יותר שונה ללמוד בכל היבט של זיהום herpesviral, לרבות השהיית הפעלה מחדש, וכדי ללמוד וירוסים אחרים, ה-DNA. יתר על כן, תיוג עם 5-ethynyl uridine (EU) עלולה לאפשר לניתוח של הגנום נגיפי RNA.

Protocol

1. תרבית תאים, זיהום נגיפי ו- EdC תיוג ( איור 1) בפרוטוקול הבא כרוך בעבודה עם וירוסים. נא עיין המוסד שלך ' s ביולוגית פרוטוקולים בדבר לטפל וירוסים ותוכנות אחרות ביולוגיים. פרוטוקול זה אושרה על ידי ועדת הבדיקה המוסדי של אוניברסיטת פיטסבורג. Trypsinize confluent 150 ס”?…

Representative Results

השימוש לחץ כימיה לטיהור של ה-DNA של תאים בוצעה לראשונה על ידי שיטת iPOND21. מטרת iPOND היא לטהר מזלגות שכפול הסלולר לצורך זיהוי חלבונים הקשורים. אנחנו הסתגלו טכניקה זו ללמוד אינטראקציות חלבון vDNA במיוחד במהלך זיהום. מניפולציה של הגישה לתייג הגנום הנגיפי עם EdC (<strong class=…

Discussion

פרוטוקול זה כולל מספר שלבים אשר, אם לא עקבו בזהירות, עלולה לגרום התשואה חלבון מופחתת באופן משמעותי או זיהום עם תאי ה-DNA. . זה קריטי כי נייח תאים משמשים לניסויים כל כדי להבטיח כי DNA הסלולר לא מתויג, מטוהרים זה יכול להיות מאושרות על ידי העדר polymerases DNA הסלולר במדגם חלבון כי HSV-1 לא לנצל את הסלולר DNA פ…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו להכיר חנה פוקס לעזרה בהכנת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH הענק R01AI030612.

Materials

MRC-5 cells ATCC CCL-171
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-082 substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM  (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate
600 cm2 tissue culture dish Thermo Fisher Scientific 166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1 stock stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best
Sephadex G-25  column (PD-10 Desalting Column) GE Healthcare 17085101
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-1
5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) Sigma-Aldrich T511307 Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
2´-deoxycytidine (deoxyC) Sigma-Aldrich D3897 Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C 
Nuclear Extraction Buffer (NEB) prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal)
Cell scraper Bellco glass 7731-22000 Autoclave before use
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
PBS, pH 7.2 (10x) 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use)
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) Fisher Scientific C489 Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month
(+) Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use
Biotin azide Invitrogen B10184 Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year 
Click Reaction Mix prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)  
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001 Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer
freezing buffer prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor)
Buffer B1 prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B2 prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor)
Buffer B3 prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe Sonics VCX 130
Cell strainer Falcon 352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65601
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
Mini-Tube Rotator Fisher Scientific 260750F
2X Laemmli sample buffer Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4  °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM.
cap locks for 1.5 mL tube Fisher Scientific NC9679153
Standard western blotting reagents
NOVEX Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
12-well tissue culture dish Corning 3513
Coverslips Fisher Scientific 12-545-100 Autoclave before use
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-5
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 dilute to 3.7% in 1x PBS before use
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605 prepare 3% in 1x PBS
Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) Sigma-Aldrich T8787 prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS
Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Molecular Probes C10337 prepare according to manufactorer's protocol
Hoechst 33342 Life Technologies H1399 prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year
mouse anti-ICP8 primary antibody Abcam ab20194 Use a 1:200 dilution in 1x PBS
mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) Abcam ab19311 Use a 1:200 dilution in 1x PBS
Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody Life Technologies a11005 Use a 1:500 dilution in 1x PBS
Immu-mount Thermo Fisher Scientific 9990402
2x SDS-bicarb solution 2% SDS, 200 mM NaHCO3
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark
chloroform:isoamyl alcohol mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use)
Qiaquick PCR purification kit Qiagen 28104
3 M sodium acetate pH 5.2
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32851
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
Fluorescence microscope equipped with imaging software
Microcentrifuge for 1.5 mL tubes
Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes
Cell culture incubator
Biosafety cabinet
Heat blocks 65 °C and 95 °C

Referencias

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

Play Video

Citar este artículo
Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56374, doi:10.3791/56374 (2017).

View Video