Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

Prion hastalıkları veya bulaşıcı spongiform Encephalopathy (TSE) insanlarda, bovine spongiform encephalopathy (BSE) içinde sığır, koyun ve keçi ve kronik boşa büyük nörodejeneratif hastalıklar Creutzfeldt – Jakob hastalığı (CJD) dahil olmak üzere çoğu hastalığı (CWD) cervids ^1,2. TSE’ler ayırt edici spongiform görünüm ve beyindeki nöronların kaybı ile karakterizedir. “Sadece protein” hipotezi göre Prionlar esas olarak PrP^Sc (büyük için ‘ Sc’) ³/, ev sahibi olarak kodlanmış hücresel prion protein, PrP^Cmisfolded izoformu oluşmaktadır. PrP^Sc PrP^C dönüştürme bağlamak ve diğer PrP^C molekülleri dönüştürmek için bir çekirdek hareket edebilir ᵦ-yaprak ^4,5,6 zenginleştirilmiş bir uyum içine kaynaklanır. Yeni oluşturulan PrP^Sc moleküllerin daha küçük reaksiyonlar, bulaşıcı çekirdekleri daha yüksek sayıda sonuçlanan bölen bir büyüyen polimer ^7,8 içine dahil edilmiştir. PrP^Sc toplamak için eğilimli ve proteaz ^9,10‘ a kısmen dayanıklıdır.

CWD etkiler vahşi ve çiftlik geyik (Cervus canadensis), katır geyiği (Odocoileus hemionus), Ak kuyruklu geyik (WTD; Odocoileus virginianus), geyik (Alces alces) ve Ren geyiği (Rangifer tarandus tarandus) ^11,12,13. Bu yatay şanzıman cervid etkileşimleri ve çevre sebat infektivite ^14,15ile en bulaşıcı deli dana hastalığı kabul edilir. Nerede PrP^Sc birikimi ve infektivite beyne sınırlı olan diğer prion hastalıkları CWD içinde bunlar da periferik doku ve vücut sıvıları örneğin tükürük, idrar ve dışkı ^16,17, bulunur ¹⁸.

İmmünhistokimya PrP^Sc dağıtım ve süngerimsi lezyonlar ^19,20algılamak CWD tanısı için altın standart olarak kabul edilir. ELISA ve daha nadir olarak, Batı leke de CWD teşhis için kullanılır. Böylece, geçerli deli dana hastalığı tanı çoğunlukla Prionlar içinde post-mortem doku tespit üzerinde temel alır. Ante-mortem tanı için CWD bademcikler veya recto anal mukoza ilişkili lenfoid doku (RAMALT) biyopsi alarak mevcuttur; Bununla birlikte, bu yordamı invaziv ve hayvanların yakalanması gerekir. Böylece, idrar ve dışkı, gibi kolayca erişilebilir örneklerin kullanımı CWD prion algılama için pratik bir yol olacaktır. Ancak, bu salgılarının liman nispeten Prionlar geçerli tanı yöntemleri algılama sınırın altındaki konsantrasyonları düşük. Sonuç olarak, daha hassas ve yüksek üretilen iş tanı aracı gereklidir. Döngüsel amplifikasyon misfolding protein gibi vitro Dönüşüm Sistemleri (PMCA) ²¹, tahlil ve gerçek zamanlı dönüşüm (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı tahlil ^22,23, tohum amiloid tahlil ²⁴ deli dana dönüştürme işleminin vitro taklit etmek için PrP^Sc kendi kendine yayılıyor yeteneği yararlanmak ve böylece dakika PrP algılanamaz düzeyleri ^{25Sc miktarda varlığı yükseltmek için çok güçlü araçlar vardır ,26}. RT zlı yöntemi, ancak, β-yapraklık ikincil yapısında zenginleştirilmiş dönüşüm ürün özellikle thioflavin T (Th-T) bağlayabilirsiniz aslında yararlanır. Bu nedenle, rekombinant PrP (rPrP) numaralı seribaşı dönüşüm üzerine Th-T bağlamak ve böylece gerçek zamanlı olarak Th-T (RFU) göreli Floresans birimler zaman içinde ifade Floresans ölçerek tespit edilebilir amiloid liflerinde içine büyür. Bir kez izlenen, RFU göreli tohumlama faaliyetleri ve gecikme faz gibi nicel parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir. Gecikme faz sırasında hangi rPrP erken aşamada tepki Th-T Floresans algılama sınırın altına dönüştürmedir eşik ulaşmak için gereken süreyi (h) temsil eder. Eşlik eden yeterli amiloid çekirdeği (çekirdekleşme/uzama) oluşumuna belirgin gecikme faz sonu Th-T Floresans eşik düzeyini aşıyor ve olumlu olur oluşur. Amiloid liflerinde gerçek zamanlı ve ilk PrP^Sc veya aşağıdaki örnekte yer alan tohumlama aktivite tespit edilebilir büyüme daha fazla tohum üreten bölümleme tarafından güçlendirilmiş. Bu tohumlar sırayla hızlı üssel faz amiloid fiber büyüme teşvik.

Çünkü bu tahlil 1 düşük tespit edebilmektedir fg PrP^{Sc 24}yüksek hassasiyet nitelendirir ante öldükten sonra ya da non-invaziv tanı çeşitli periferik dokulara, salgılarının veya diğer PrP^Sc tespit ederek elde etmek için bu tekniği numune infektivite seviyesinin düşük yataklık tür. RT zlı kesinlikle avantajları diğer deneyleri tekrarlanabilirlik, pratiklik, hız (az 50 h) ve BİYOANALİZLER için karşılaştırıldığında düşük maliyetleri sağlar. O PMCA içinde kullanılan sonication gibi teknik karmaşıklığı önler; Ayrıca, hangi her şey aerosol bulaşma riskini en aza indirgemek bir bant mühürlü Mikroplaka içinde gerçekleştirilir. Çok iyi biçimi aynı deneyi 96 örnekleri çözümleme sağlar. Tekrarlayan sorunun yanlış pozitif ve rPrP vitro dönüşüm deneyleri içinde spontan dönüşüm karşı bir eşik (cut-off) RT zlı uygulanması çok yararlıdır. Nitekim, negatif kontrol (ortalama RFU negatif örnekler + 5 SD ²⁷) sonuçlarına göre bir temel hangi-ebilmek kılınmak ayrımcılık pozitif ve negatif örnekleri arasında ayarlanır. Dört çoğaltır kullanım örnekleri için böylece çoğaltır en az % 50 olumlu bir sinyal gösterdiğinizde bir örnek pozitif tanımlamak için yardımcı olabilir, Yani çapraz kesme ²⁸. Örneğin bir önceki çalışmada, hamster rPrP insan PrP^vCJD homolog substrat kıyasla daha duyarlı bir substrat olmak tohumlari ve koyun büyük tepkiler ^{numaralı seribaşı tespit edildi gibi homoloji arasında tohum ve substrat RT içinde zlı, gerekli değildir 29}. hamster-koyun chimeric rPrP da insan varyant CJD Prionlar ³⁰algılamak için insan rPrP daha daha iyi uygun bir substrat olmasını önerdi. Böylece, farklı türlerden rPrP yüzeylerde kullanımı bu tahlil çok yaygındır. Bu tahlil sporadik CJD ^31,32,33, gen gibi birkaç prion hastalıkları için başarıyla uygulandıETIC prion hastalıkları ³⁴, BSE ^35,36,37, büyük ^23,36ve CWD ^{38,39,40,41, 42}. RT zlı içinde tohum PrP^{Sc 38,39,40,41,} tespit etmek için tüm başarılı olduğu gibi çalışmalar kullanarak beyin omurilik sıvısı, tam kan, tükürük ve idrar işlenen ⁴². örneklerinde inhibitörleri Amiloid Dil oluşumu içerebilir kan plazması gibi algılama yeteneği teşvik etmek için Orrú ve ark. (2011) Amiloid Dil oluşumu potansiyel inhibitörleri PrP^Sc immunoprecipitation (IP) adım ve RT-QuIC tarama ile kaldırmak için bir strateji geliştirdi, tahlil (eQuIC) “QuIC gelişmiş” adında. Buna ek olarak, bir yüzey yedek adım duyarlılığını artırmak için reaksiyon süresi ~ 24 h sonra istihdam edildi. Sonuçta, olarak düşük 1 ag PrP^Sc eQuIC ³⁰tarafından algılanabilir.

Dışkı özleri arındırmak ve olası tahlil inhibitörleri dışkı çıkarmak için dışkı örnekleri preklinik ve klinik aşamalarında elk deneysel oral enfeksiyon üzerine toplanan deterjanlar ve proteaz inhibitörleri içeren arabellekte homojenize. Dışkı özleri daha fazla protein yağış ile sodyum phosphotungstic asit (NaPTA) yağış kullanan örnekler PrP^Sc konsantre için farklı yöntemler için sunuldu. Önce Safar vd tarafından açıklanan NaPTA yağış yöntemi ⁴³, PrP^Sc test örneklerinde konsantre için kullanılır. NaPTA kuluçka PrP^Cyerine PrP^Sc tercihli yağış örnek sonuçlarını içeren. Ancak, moleküler mekanizma hala belli değildir. Bu adımı da içeren ve bazı durumlarda görülmektedir rPrP spontan dönüşüm önleme yardım etti. Son olarak, dışkı özleri en iyi duruma getirilmiş RT-fare rPrP (aa 23-231) bir substrat kullanarak ve yüzey yedek iletişim kuralında dahil algılama hassasiyeti artırmak için zlı tarafından test edildi.

Sonuçlar burada geliştirilmiş bu yöntem çok düşük konsantrasyonlarda CWD Prionlar algılayabilir ve algılama ve özgüllük dışkı örneklerinde NaPTA yağmur damlaları ve yüzey yedek olmadan bir iletişim kuralına göre hassasiyeti artar gösterilmektedir. Bu yöntem potansiyel olarak diğer doku ve vücut sıvıları uygulanabilir ve vahşi ve esir cervids CWD gözetimi için büyük kullanım olabilir.