في الوقت الحقيقي مهتز الناجمة عن تحويل الفحص للكشف عن البريونات CWD في المواد البرازية

أمراض بريون أو الاعتلال الاسفنجي (تسي) اضطرابات الأعصاب بما في ذلك كروتزفيلد-جاكوب (جاكوب) في البشر، والتهاب الدماغ الاسفنجي البقري (مرض جنون البقر) في الماشية، الرعاش في الأغنام والماعز، والهزال المزمن المرض (CWD) في سيرفيدس ^1،2. الاسفنجي تتميز بالمظهر الاسفنجي مميزة وفقدان الخلايا العصبية في الدماغ. طبقاً لفرضية “البروتين فقط”، البريونات هي تتألف أساسا من الحزب الثوري^Sc (‘المحكمة العليا’ الرعاش) ³، isoform تجمعات من البروتين ترميز المضيف بريون الخلوية، الحزب الثوري^ج. PrP^Sc ناتجة عن تحويل PrP^ج إلى المطابقة التخصيب في^{5، 4،}ᵦ-أوراق⁶ التي يمكن أن تعمل كبذرة لربط وتحويل الجزيئات PrP^ج الأخرى. جزيئات PrP^{اتفاقية استكهولم} الذي تم إنشاؤه حديثا أدرجت في ^7،بوليمر تنامي⁸ الذي اخترق ليغومرات الأصغر، أسفرت عن أكبر عدد من الأنوية المعدية. PrP^{اتفاقية استكهولم} هو عرضه للتجميع ومقاومة جزئيا إلى ^9،البروتياز¹⁰.

CWD يؤثر الأيائل البرية والمستزرعة (سيرفوس canadensis)، والوعول (هيميونوس أودوكويليوس)، والأبيض – الذيل الغزلان (يوم الذكرى العالمي؛ فيرجينيانوس أودوكويليوس)، موس (السيس السيس)، والرنة (رانجيفير تاراندوس تاراندوس) ^11،،من¹²¹³. ويعتبر هذا المرض بريون المعدي أكثر مع انتقال أفقي يفضلها سيرفيد التفاعلات والثبات البيئي للعدوى ^14،15. خلافا لسائر الأمراض بريون حوصر فيها تراكم PrP^{اتفاقية استكهولم} والعدوى إلى المخ، في CWD هذه توجد أيضا في الأنسجة المحيطية وسوائل الجسم مثل اللعاب والبول والبراز ^{16،17، 18}.

إيمونوهيستوتشيميستري يعتبر معيار الذهب لتشخيص CWD الكشف عن توزيع PrP^{اتفاقية استكهولم} والإسفنجي آفات ^19،20. أليسا وفي حالات نادرة، كما تستخدم لطخة غربية لتشخيص CWD. وهكذا، تشخيص المرض بريون الحالي يعتمد أساسا على اكتشاف البريونات في الأنسجة بعد الوفاة. يتوفر التشخيص الوفاة ل CWD بأخذ اللوزتين أو خزعات يمنى الشرج الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (رامالت)؛ ومع ذلك، هذا الإجراء الغازية ويتطلب القبض على الحيوانات. وهكذا، سيكون استخدام العينات الوصول إليها بسهولة، مثل البول والبراز، طريقة عملية لكشف بريون CWD. بيد تلك الفضلات هاربور المنخفضة نسبيا لتركيزات البريونات الكشف عن الحد الأدنى لطرق التشخيص الحالية. ونتيجة لذلك، هناك حاجة إلى أداة تشخيصية أكثر حساسية وعالية إنتاجية. في المختبر نظم التحويل، مثل البروتين misfolding التضخيم دوري الاعتداء (بمكا) ²¹، اميلويد بذر المقايسة، والتحويل في الوقت الحقيقي التي يسببها مهتز (RT-كويك) مقايسة ^{22،23، 24} أدوات قوية جداً استغلال قدرة ذاتية نشر PrP^{اتفاقية استكهولم} على تقليد في المختبر بريون عملية التحويل وتضخيم وبالتالي وجود كميات دقيقة من الحزب الثوري الشعبي^{اتفاقية استكهولم} إلى مستويات لا يمكن اكتشافها ^{25 ،26}. ومع ذلك، يأخذ الأسلوب RT كويك، استفادة حقيقة أن المنتج تحويل أثري في هيكل الثانوية β-ورقة تحديداً ربط ثيوفلافين تي (ال تي). ولذلك، ينمو PrP المؤتلف (ربرب) عند تحويل المصنف إلى ييفات اميلويد الذي ربط ال تي، وهكذا يمكن الكشف عن في الوقت الحقيقي عن طريق قياس الأسفار من ال تي معبراً عنها بوحدات fluorescence النسبي (رفو) مع مرور الوقت. مجرد رصد، يمكن استخدامها في رفو لتقييم أنشطة بذر النسبي، والمعايير الكمية مثل مرحلة انتقالية. يمثل مرحلة انتقالية الوقت (ح) المطلوب للوصول إلى العتبة، خلال الذي ربرب التحويل في المرحلة المبكرة من رد فعل أقل من الحد الكشف من الأسفار ال تي. عند نهاية المرحلة الفاصلة الواضحة، الملازمة لتشكيل نواة اميلويد كافية (نويات/استطالة)، الأسفار ال تي يتجاوز مستوى الحد الأدنى ويصبح إيجابيا. نمو اميلويد ويمكن الكشف عن ييفات في الوقت الحقيقي، و الحزب الثوري الأولى^{اتفاقية استكهولم} أو بذر النشاط الواردة في العينة يتم تضخيمه بتجزئة الذي يولد المزيد من البذور. هذه البذور يدفع بدوره إلى مرحلة أسي سريع لنمو الألياف اميلويد.

لأن هذا التحليل قادرة على كشف منخفضة 1 fg PrP^{اتفاقية استكهولم 24}، حساسية عالية يؤهل هذا الأسلوب لتحقيق الوفاة أنتي أو التشخيص غير الغازية عن طريق الكشف عن^{اتفاقية استكهولم} من الحزب الثوري الشعبي في مختلف الأنسجة الطرفية، والإفرازات أو غيرها أنواع العينة إيواء مستويات منخفضة من العدوى. RT كويك يوفر بالتأكيد مزايا أكثر من غيرها فحوصات لإمكانية تكرار نتائج والتطبيق العملي، والسرعة (أقل من 50 ح) وتكاليف منخفضة مقارنة بالمقايسة. وهو يتجنب التعقيدات التقنية مثل سونيكيشن المستخدمة في بمكا؛ أيضا، فإنه يتم في ميكروسكوبية مختومة الشريط الذي يقلل من خطر تلوث الهباء الجوي لكل بئر. ويمكن تنسيق متعدد جيدا تحليل عينات تصل إلى 96 في نفس التجربة. لمواجهة هذه المشكلة المتكررة من إيجابيات كاذبة والتحويل التلقائي من ربرب في فحوصات التحويل في المختبر تنفيذ عتبة (الوقف) في الرايت كويك مفيد جداً. في الواقع، استناداً إلى نتائج المراقبة السلبية (رفو متوسط العينات السلبية + 5 SD ²⁷)، أساس هو إعداد من الذي يمكن أن يتم التمييز بين نماذج إيجابية وسلبية. وهكذا يمكن أن تساعد استخدام replicates أربعة لكل عينة لتحديد عينة إيجابية عند 50 في المائة على الأقل من replicates إظهار إشارة إيجابية، أي عبور وقف إنتاج المواد الانشطارية ²⁸. ليس مطلوباً التماثل بين البذور والركيزة في الرايت-كويك، كما مثلاً في دراسة سابقة، ربرب الهامستر تم العثور على أن تكون أكثر حساسية ركيزة الركيزة مثلى في البشر PrP^جنون بالمقارنة مع المصنف والمصنف الرعاش الأغنام ردود فعل ²⁹. ربرب تشيميريك الهامستر-الأغنام كما اقترح أن تكون ركيزة أكثر مناسبة من ربرب البشرية لاكتشاف البريونات جاكوب المتغير البشري ³⁰. وهكذا، استخدام ركائز ربرب من مختلف الأنواع شائعة جداً في هذا التحليل. هذا التحليل قد طبقت بنجاح على عدة أمراض بريون، مثل متفرقة جاكوب ^31،،من³²³³، الجنرالأمراض بريون آتيك ³⁴ومرض جنون البقر ^35،،من³⁶³⁷والرعاش ^23،36و CWD ^38،39،،من^{4041، 42}. الدراسات باستخدام معالجة النخاعي وكل الدم واللعاب والبول كما البذور في الرايت كويك كانت كلها ناجحة للكشف عن الحزب الثوري^{Sc 38،39،،}من^{4041، 42}-لتعزيز قدرة الكشف في عينات مثل بلازما الدم التي قد تحتوي على مثبطات لتشكيل اميلويد، Orrú وآخرون. ووضعت استراتيجية لإزالة الموانع المحتملة لتشكيل اميلويد بتمشيط PrP^Sc إيمونوبريسيبيتيشن (IP) الخطوة و RT-قويك (2011)، والمسمى ” زيادة قويك ” المقايسة (إكويك). وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت خطوة استبدال الركيزة بعد ~ 24 ساعة وقت رد الفعل من أجل تحسين الحساسية. وفي نهاية المطاف، ك ag من الحزب الثوري الشعبي^{اتفاقية استكهولم} منخفضة 1 كان يمكن كشفها بواسطة إكويك ³⁰.

من أجل تنقية مقتطفات البراز وإزالة مثبطات الإنزيم الممكنة في البراز، كانت تجانس عينات البراز التي جمعت في المراحل السريرية والسريرية من الأيائل على العدوى عن طريق الفم التجريبية في مخزن يحتوي على المنظفات ومثبطات البروتياز. كذلك قدمت مقتطفات البراز إلى منهجيات مختلفة تركيز PrP^{اتفاقية استكهولم} في العينات التي تستخدم ترسيب البروتين عن طريق الصوديوم فوسفوتونجستيك هطول الأمطار الحمضية (ناتا). الأسلوب هطول الأمطار ناتا، وصف لأول مرة من صفر et al. ⁴³، يستخدم لتركيز PrP^{اتفاقية استكهولم} في عينات الاختبار. الحضانة ناتا مع نتائج العينة في هطول الأمطار التفضيلية PrP^Sc بدلاً من الحزب الثوري^ج. ومع ذلك، الآلية الجزيئية لا تزال غير واضحة. وساعدت هذه الخطوة أيضا احتواء ومنع التحويل التلقائي من ربرب، الذي لوحظ في بعض الحالات. أخيرا، تم اختبار مقتطفات البراز بالامثل RT-كويك استخدام الماوس ربرب (aa 23-231) كركيزة، بما في ذلك استبدال الركيزة في البروتوكول تحسين حساسية الكشف.

وتبين النتائج هنا أن هذه الطريقة تحسن يمكن الكشف عن تركيزات منخفضة جداً من البريونات CWD، ويزيد من حساسية الكشف والتحديد في عينات البراز مقارنة ببروتوكول دون استبدال هطول الأمطار والركيزة نابتا. يحتمل أن هذا الأسلوب يمكن تطبيقه على الأنسجة وسوائل الجسم الأخرى، ويمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة لمراقبة CWD في سيرفيدس البرية والاسيرة.