Essai de phagocytose pour les cellules apoptotiques dans<em> Drosophila</em> Embryons

Dans les animaux métazoaires, par exemple, le nématode Caenorhabditis elegans , la mouche à fruits Drosophila melanogaster , et les souris et les humains, un grand nombre de cellules subissent une apoptose au cours du développement pour façonner leur corps et à l'âge adulte pour maintenir l'homéostasie ^{1 , 2} . Les cellules apoptotiques doivent être rapidement éliminées car elles induisent une inflammation dans les tissus environnants en libérant des matériaux intracellulaires immunogènes, sinon complètement éliminés ³ . Afin de faciliter l'élimination rapide, les cellules apoptotiques présentent les signaux dits "eat-me" qui sont reconnus par les récepteurs d'engulfment des phagocytes et sont éliminés par phagocytose ^{3 , 4 , 5 , 6} . Ainsi, la phagocytose joue un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie de l'hôte et donc, l'élucidation de la molécule Les mécanismes marquants sous-jacents à la phagocytose des cellules apoptotiques sont importants.

Les mécanismes responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques semblent être conservés d'une manière évolutive chez les espèces des nématodes, des mouches et des souris ⁷ . Plusieurs tests de phagocytose sont actuellement disponibles pour évaluer l'absorption de cellules apoptotiques dans ces modèles d'animaux. Dans C. elegans , 131 cellules somatiques subissent une mort cellulaire programmée pendant le développement, et les cadavres cellulaires sont phagocytés par des cellules voisines, qui sont des phagocytes non professionnels ⁸ . Ainsi, le nombre de cadavres de cellules restants dans C. elegans indique le niveau de phagocytose in vivo . En recherchant des mutants de nématodes qui montrent un nombre accru de cellules mortes, plusieurs gènes requis pour la phagocytose ont été identifiés et caractérisés génétiquement ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

Des tests de phagocytose ex vivo avec des phagocytes de culture primaire, généralement des macrophages, sont souvent utilisés chez la souris. Les cellules apoptotiques sont préparées en utilisant des lignées cellulaires telles que des cellules Jurkat, et sont mélangées avec des phagocytes primaires. Après une incubation pendant plusieurs heures, le nombre total de phagocytes et de phagocytes engloutis sont comptés afin d'évaluer le niveau de phagocytose. En tant que modification sophistiquée de cette méthode, le groupe de Nagata a développé un test de phagocytose ex vivo avec des cellules exprimant une ICAD résistante aux caspases (inhibiteur de la DNase activée par caspase), dans laquelle les cellules apoptotiques ne subissent pas de fragmentation de l'ADN apoptotique, mais l'ADN est encore clivé lorsque Les cellules sont phagocytées. Lorsque ces cellules sont utilisées comme cibles apoptotiques dans un test de phagocytose, seul l'ADN des cellules apoptotiques englouties est fragmenté et coloré par un marquage de l'extrémité du DUTP médié par TdT (TUNEL). Par conséquent, le niveauL de l'absorption de cellule apoptotique est mesurée en comptant les signaux TUNEL dans un mélange de phagocytes et de cellules apoptotiques ¹³ .

Dans D. melanogaster , les phagocytes professionnels appelés hémocytes, les macrophages de Drosophila , sont responsables de la phagocytose des cellules apoptotiques ^{14 , 15} . En plus des essais de phagocytose in vitro avec des lignées cellulaires de culture, des tests de phagocytose in vivo avec des embryons complets de Drosophila sont disponibles. Les embryons de Drosophila sont un outil puissant pour examiner le niveau d'absorption des cellules apoptotiques car de nombreuses cellules subissent une apoptose et sont phagocytées par des hémocytes pendant le développement embryonnaire ^{14 , 15 , 16} . Un exemple d'un test de phagocytose in vivo est la méthode développée par le groupe de Franc. Dans leur méthode, les hémocytes sont lesProtégés par l'immunocoloration de la peroxidasine, un marqueur d'hémocyte, des cellules apoptotiques sont colorées en utilisant le colorant nucléaire, la 7-amino actinomycine D dans des embryons de Drosophila entiers, et le nombre de cellules posologiques doubles est considéré comme un signal de phagocytose ¹⁷ . Un autre exemple d'un test de phagocytose sur des embryons est basé sur le concept de la méthode de Nagata décrit ci-dessus; Cependant, la phagocytose in vivo est évaluée à l'aide des embryons de DNC ( Drosophila caspase-activase DNase) mutants flies ^{18 , 19} . Ces tests de phagocytose in vivo sont utiles pour observer directement la phagocytose in situ . Cependant, des difficultés sont associées à exclure tout biais possible dans l'étape de compter les cellules phagocytes car il est difficile d'observer tous les phagocytes et les cellules apoptotiques dans les embryons entiers en raison de leur épaisseur.

Pour surmonter cette limitation, nous développonsUn nouvel essai de phagocytose dans des embryons de Drosophila . Dans notre méthode, afin de compter facilement les hémocytes phagocytants, les embryons entiers sont homogénéisés pour préparer des cellules embryonnaires dispersées. Les phagocytes sont détectés par l'immunocoloration d'un marqueur de phagocytes, et les cellules apoptotiques sont détectées par TUNEL avec ces cellules embryonnaires dispersées. L'utilisation de cellules embryonnaires dispersées nous permet de mesurer les niveaux de phagocytose in vivo comme si nous avons effectué un test de phagocytose in vitro qui quantifie précisément le niveau de phagocytose. Tous les génotypes de mouches peuvent être utilisés dans ce dosage si elles se développent au stade 16 des embryons ²⁰ , le stade de développement au cours duquel la clairance cellulaire apoptotique par phagocytose est la plus abondante. Cette méthode présente l'avantage d'évaluer quantitativement le niveau de phagocytose et peut donc contribuer à l'identification de nouvelles molécules impliquées dans la phagocytose des cellules apoptotiques in vivo .