JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Published: October 02, 2017
doi:
10.3791/56294
, , ,
1Diamond Light Source,Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell,Harwell Science & Innovation Campus

Summary

פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.

Abstract

פיתוח חדש antimicrobials חיסונים עבור pneumoniae סטרפטוקוקוס (pneumococcus) נחוצים לעצור את העלייה המהירה של זנים עמידים בפני מרובות. פחמימות המצע מחייב חלבונים (SBPs) מייצגים קיימא מטרות פיתוח חיסונים מבוססי חלבונים ו- antimicrobials חדש בגלל לוקליזציה חוץ-תאית שלהם ואת מרכזיותה של פחמימות ייבוא לחילוף החומרים pneumococcal, בהתאמה. המתוארים כאן הוא פרוטוקול משולב rationalized לבצע אפיון מקיף של SP0092, אשר ניתן להרחיב פחמימות אחרות, SBPs את pneumococcus, חיידקים אחרים. הליך זה יכול לסייע העיצוב מבוסס על מבנה של מעכבי עבור מחלקה זו של חלבונים. שהוצגו בחלק הראשון של כתב יד זה הפרוטוקולים עבור ניתוח הביוכימי לפי משמרת תרמי assay, ריבוי זווית פיזור אור (MALS), גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות), אשר למטב את היציבות, למזהים ייחודיים של הומוגניות של המדגם התגבשות ניסויים, וכך לשפר את ההסתברות להצלחה. החלק השני של הליך זה מתאר את האפיון של הקריסטלים SBP באמצעות של אורך גל tunable עקיפה חריגה סינכרוטרון הפרעות לקרן החלקיקים ופרוטוקולי אוסף נתונים עבור נתוני מדידה יכול לשמש כדי לפתור את החלבון מגובשת מבנה.

Introduction

ס pneumoniae (pneumococcus) הוא חיידק גראם חיוביים המתגוררים asymptomatically את דרכי הנשימה העליונות של מערכת הנשימה האנושית עם היכולת להגר נישות סטרילי בדרך כלל גורם ספטיסמיה אלח-דם, דלקת ריאות, דלקת אוזניים, דלקת קרום המוח1,2. יתר על כן, זיהום pneumococcal הוא הגורם המוביל של דלקת ריאות שנרכשה בקהילה, אשר תורמת נטל קלינית וכלכלית ברחבי העולם3,4. זנים עמידים לאנטיביוטיקה של ס’ pneumoniae התפשטו ברחבי העולם, למרות של שבע-עמודים ולנטיין ו 13-האהבה, בדיקת החלבון המצומד pneumococcal תרכיב חיסון סייעו להקטין את הקצב של עמידות מיקרוביאלית, החלפת זנים של השימוש בחיסון הופיעו, הובילו מוגברת למחקר לתוך לפיתוח טיפולים חדשים עבור המחלה pneumococcal5,6,7,8.

Pneumococcus תלוי סוכרים מיובאים מהמחשב המארח פחמן מקור9,10; אכן זה מקדיש שלושים אחוז שלה מכונות ייבוא להעברה של 32 פחמימות שונים11,12,13. יבואנים אלה כוללים ABC-מובילי לפחות שמונה13. ב- ABC מובילים, SBPs חוץ-תאית לשחק תפקיד מהותי בקביעת יחודיות עבור ליגנד והצגתו המשגר ממברנלי אינטגרלי עבור ספיגת בתא. SBPs מייצגים תקף מטרות על עיצוב האתר של חיסונים חדשים, antimicrobials כי הם פני שטח חלבונים ותפקידם חיוני תהליכים תאיים.

תיאור מפורט של תכונות מבניות, כמו כיסים ליגנד וגמישות עיבד, ואפיון של חלבונים היעד לספק כלי שימושי עבור תרופה המבוססת על מבנה עיצוב14,15. קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן היא שיטת הבחירה אפיון מבניים של חלבונים-קרוב ברזולוציה אטומית, אך תהליך התגבשות הוא בלתי צפוי, גוזלת זמן, לא תמיד מוצלח. שיטות שיטתית השתפרו שיעור ההצלחה והם גורמים חשובים הדגימה איכות ויציבות. שיעור ההצלחה של התגבשות מושפעת חלבון הכימיות ומתודולוגיה הכנת המדגם. ההשפעה של אלה יכול להיות מוערך, הודיע על ידי איפיון ביוכימי16,17.

סיבוך נוסף לעיצוב מבוסס על מבנה הבעיה שלב לחקר הגבישים, אשר יש להתייחס. כמו מבנים חלבונים נוספים הפכו זמינים, מבנים רבים יכולים להיפתר על ידי שיטת החלפת מולקולרית, המחייב של מבנה הומולוגי18. כפי SBPs להציג מבנה תחום גמיש, החלפת מולקולרית יוכיח גם מאתגר19. אם מודל מבנית דומה מספיק חלבון המטרה אינה זמינה, מספר טכניקות ניתן להשיג את phasing ניסיוני20. בין אלה, שיטת הפיזור חריג יחיד באורך הגל (SAD) התפתחה הטכניקה העיקרית, נעשה שימוש נרחב כדי לפתור את הבעיה של שלב21. השימוש בשיטת עצוב כבר מתקדמים עוד יותר עם שיפורים בחומרה, תוכנה, כמו גם אסטרטגיות אוסף נתונים כדי לאפשר את איתור ושימוש של אותות כמשוגעת חלש עבור בהדרגה22,23, 24. יתר על כן, מקדמות שיטות ישירות עבור פתרון מבנים של מקרומולקולות, שבעבר נדרש עקיפה נתונים ברזולוציה אטומית, יכול עכשיו להיות מנוצל על ידי שילוב הידע סטריאוכימיים לדוגמה, כפי ליישם את התוכנית ARCIMOLDO25. סקירה שימושית של שיטות לפתרון בעיית הפאזה ב קריסטלוגרפיה ניתנת על ידי טיילור26.

כאן אנו מציגים פרוטוקול rationalized עבור אפיון התעבורה פחמימות SBP, SP0092 של ס’ pneumoniae, שילוב טכניקות הביוכימי ומבניים (איור 1). פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק מקרה מבחן דוגמא שימושית של אסטרטגיות כדי לשפר את שיעור ההצלחה של מחקרים מבניים על SBPs באופן כללי, אשר נמצאות כל הממלכות של החיים. בפרט, הפרוטוקול מדגיש את החשיבות של אפיון המדינה היציבה ביותר oligomeric של החלבון בתמיסה בשיטת מהיר ויעיל, ומאפשרת זיהוי המין הטוב ביותר לעקוב אחר לניסויים התגבשות. למרות שיש מעל 500 מבנים SBP דיווח של בנק מידע החלבונים27, החלפת מולקולרית עשויה להיות מאתגרת בשל אופיו גמיש הטבועה של שתי α/β קבוצות המחשבים, אשר מחוברים באמצעות אזור ציר19. לפיכך, החלק השני של הפרוטוקול מתאר שימוש בשיטת עצוב עבור בהדרגה ממאוגד יונים מתכתיים, אשר נפוץ ב SBPs, כמו גם שילוב של selenomethionine ושימוש של סלניום (Se) בהדרגה עצוב.

Protocol

הערה: רצף קידוד אשר נמחק את פפטיד אות שוכפל ב וקטור pOPINF בעקבות פרוטוקול תקני ב- fusion; החלבון יליד מבוטאת פיוז’ן שלו-תג בתאים Escherichia coli BL21 רוזטה 28 , 29. selenomethionine עם התווית variant מתבטא בעקבות בשיטות הרגילות על-פי יצרן 30. רקומביננטי SBP מטוהר כאמור תיאר 31 , 32- 1. איפיון ביוכימי תרמית להעביר assay 48 להכין מאגר פתרונות עם pH החל מ- 4.0 9.5 וריכוז NaCl בין 0 ל- 0.5 M, לוותר על 40 µL בצלחת 96-ובכן כפי שמתואר טבלה 1 33. להוסיף לכל µL 5 טוב של הפתרון SBP-ריכוז 1-2 מ”ג/מ”ל. להוסיף לכל µL 5 טוב של 20 x הכתם פלורסנט חלבונים (ראה טבלה של חומרים). לערבב את הפתרונות על ידי pipetting, לאטום את הצלחת באמצעות סרט דביק שקוף וספין למשך 2 דקות ב g x 112 בטמפרטורת החדר. להפעיל את הניסוי על מכונת אמת: הגדר רמפה בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס/דקה 4 99 ° C עם זמן המתנה s 10 ולאחר לקרוא את קרינה פלואורסצנטית כל 0.5 ° C עם עירור ב 483 nm, פליטה-568 nm. לנתח את עקומות פליטת קרינה פלואורסצנטית עבור כל תנאי מאגר, זיהוי את טמפרטורת ההיתוך (T m) המינימום של הנגזרת. הערה: הליך זה נותן סימן טוב של הפתרון מאגר הטוב ביותר כדי לסייע לשיפור היציבות חלבון. בחר את טווח pH ריכוז המלחים המבוסס על תנאי מאגר עם ה-T הגבוהה מ’ ולהוסיף 2.5% (v/v) גליצרול ו 0.5 מ מ של tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) כדי להגדיר את בופר עבור השלבים הבאים (שניה-מאגר). MALS ושל שניה אנליטית לבצע שטיפה כרך שני טורים של העמודה סינון מראש ארז ג’ל עם מים מסוננים degassed (שימוש מגוון רחב משקל מולקולרי 24 mL עמודה). להתחבר העמודה הגלאי פיזור אור, equilibrate את העמודה עם המאגר שניה נחוש מ וזמינותו shift תרמי. µL להזריק 100 של SBP מטוהרים-5 מ”ג/מ”ל לתוך equilibrated שניה טור וזרימה עמודה אחת נפח שניה-buffer- לבדוק את chromatogram • תנאי יחיד או מספר פסגות, לבדוק את נתוני הפיזור באמצעות התוכנה ניתוח, קבלת המסה טוחנת מדד polydispersity עבור כל המינים. הערה: עבור כל שיא המתאימים זן oligomeric, זה מועיל לבדוק את polydispersity אינדקס מחושבת המסה טוחנת משוקלל על מסה מסת/טוחנת משוקלל על מספר מולקולות (Mw/Mn). ערך polydispersity קרוב ל- 1 מציין לשיא monodispersed. הערה: לאחר כל המינים oligomerization מוגדרים, כן הוא שימושי ללמוד תלותם ריכוז חלבון, כמו ריכוז גבוה עשוי להעדיף היווצרות אוליגומר גדול יותר. להורג מספר הרצפים שניה אנליטי; להזריק 100 µL של SBP מטוהרים-ריכוז (0.1 – 10 מ”ג/מ”ל) לתוך העמודה סינון ג’ל equilibrated (שימוש עמודה 5 mL מגוון רחב משקל מולקולרי), לזרום אחסון אחד עמודה שניה-מאגר בכל פעם. לבדוק את chromatogram • תנאי יחיד או מספר פסגות ולנתח את עוצמות ספיגת ב 280 nm של עקומות המתאים ריכוזים שונים של חלבון המוצא. אם עוצמות היחסי של הפסגות שונים נשארת קבועה, ללא המרה בין בין המינים oligomeric קיים. וריאציה של עוצמות היחסי בריכוזים שונים הן סימן interconversion בין מינים שונים oligomeric התלויים ריכוז חלבון. הערה: שלב אפיון זה היסוד להגדיר אילו זנים מתאימים יותר עבור התגבשות. אכן, מינים נפרדים monodispersed הם נוטים להתגבש אם הם במצב oligomeric יציב-ריכוז מוגדרים. 2. התגבשות והכנה של חלבון מפוח שניה לאחר אמצעי אחסון עמודה אחת לשטוף עם מים מסוננים degassed, equilibrate עם שניה-buffer העמודה סינון ג’ל מראש ארז מפוח (מגוון רחב מולקולרית משקל 120 מ ל עמודה). להזריק 1-5 מ של SBP מטוהרים ב 5-50 מ”ג/מ”ל לתוך ג’ל equilibrated סינון העמודה ואת זרימת עמודה אחת נפח שניה-buffer- לאסוף את העמודה הזרימה דרך 1 מ”ל שברים. מאגר שברים המקביל לשיא monodisperse יחיד; ספין המדגם מסננים צנטריפוגה 15 מ”ל ב 1,500 g ולכמת את הריכוז עד הריכוז הרצויה מושגת (בדרך כלל 50-100 mg/mL עבור SP0092). התגבשות לקבוע טווח ריכוז אופטימלי עבור הניסוי התגבשות באמצעות בדיקה טרום התגבשות של כפי שתואר על ידי היצרן: Dispense 0.5 – 1.0 מ”ל של כל אחד של המבחן התגבשות ארבע פתרונות מאגר שונים של 24-ובכן יושב זרוק התגבשות צלחת- להכין את הטיפות התגבשות על ידי ערבוב 1 µL של חלבון פתרון עם 1 µL של המאגר פתרון לאטום את הצלחת, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לא פחות מ 1 h (תוצאות אמינות יותר מתקבלים לאחר לילה הדגירה). לבדוק את האיכות טיפה כל הריכוז באמצעות מיקרוסקופ הגדלה 10 x- הערה: בדיקת ריכוז חלבונים שונים לפחות שלושה: (I) רוב הטיפות שנותרו ברור עולה כי החלבון הוא גם שתדללו על התגבשות; (II) הנוכחות של התמיסה כבד ברוב המכריע של הטיפות מרמז על ריכוז גבוה יתר על המידה; ו- (III) מאוזנת מופע של טיפות ברור והן התמיסה (עדיף אם קל) היא אינדיקציה טובה כי ריכוז שנבדקו היא חיובית על התגבשות. להכין המסירה ישיבה 96-ובכן התגבשות צלחות; לוותר על µL 100 של התגבשות מסחרי אחר פתרון כל מאגר טוב 34 , 35 , 36 , 37. 100 מדבקות/ברקודים nL חלבון מדגם-ריכוז שהוגדרו בעבר (שלב 1.1.6) בכל התגבשות טיפה הבארות באמצעות מערכת רובוטית התגבשות. פתרונות nL 100 מדבקות/ברקודים של המאגר שונה המתאים התגבשויות ירידה בארות לערבב עם חלבון בגליל בשלב 2.2.3. לאטום את הצלחת התגבשות כדי למנוע אידוי ולאפשר את equilibration הירידה התגבשות עם המאגר. לבדוק את הטיפות מעת לעת (בתחילה כל 1-2 ימים, לאחר מכן כל שבוע) באמצעות סימן x 10 (לפחות) הגדלה במיקרוסקופ כדי להעריך את קריסטל ההיווצרות והגידול. הערה: מערכת הדמיה אוטומטית התגבשות חלבון יכול לשמש עבור טיפות ויזואליזציה ולכידה.

3. איסוף נתונים רנטגן ואפיון קריסטל קריסטל הרכבה להכין את הפתרון cryoprotectant על-ידי הוספת 25% (v/v) גליצרול (ריכוז סופי) לתנאי התגבשות (וכך להחליף 25% מים הראשונית תערובת) 38. מלא קצף דיואר עם חנקן נוזלי והמקום החלק מארז מדגם של uni-דיסקוס לתוך דיואר. לאפשר לה להתקרר לטמפרטורת חנקן נוזלי. לחתוך ולהסיר אטימה קלטת מהצלחת התגבשות על הירידה שבו נוצרים הקריסטלים. מקום ירידה של 1 µL של פתרון cryoprotectant אל coverslide ממוקם בסמיכות הירידה היעד. להעביר את הקריסטל שנבחר מהמסירה המקורי לירידה cryoprotectant פתרון באמצעות הקפאה-לולאת ניילון על בסיס סטנדרטית השדרה רכוב על 39 , מטה מגנטי 40. העבר במהירות את הקריסטל מהמסירה cryoprotectant חנקן נוזלי, הצבת הלולאה אל המיקום הריק הראשון של בעל מדגם uni-פאק. חוזר (מתוך השלב לחתוך סרט איטום) עד כל הקריסטלים הרצויים נמצאים שנקטפו ומאוחסנים בעל מדגם uni-פאק. המקום uni-הדיסקוס לבסס על הדיסקית uni באמצעות מטה הדסקית ולקחת את הדיסקית הפרעות לקרן החלקיקים (בתנאים חנקן נוזלי). התראה: מאוד נמוכה טמפרטורת! המלקחיים הקפאה ולהשתמש הדיסקית דיואר כלי הטעינה לטעון והאיגוד-puck(s) לתוך הרובוט מחלף מדגם הפרעות לקרן החלקיקים דיואר. בעל מדגם uni-פאק הם ינותקו מן המכסה הבסיס עוזב את בעלי לולאה דגימה זקוף ב הרובוט מדגם דיואר, ולכן חשופים החנקן הנוזלי ונגיש לרובוט מחלף דגימת. קריסטל אפיון הערה: אז יכול להיות מוקרן הקריסטלים שנקטפו לאיכות עקיפה באמצעות גם מקור רנטגן מעבדה או מקור רנטגן סינכרוטרון קרינה (SR). Beamlines macromolecular קריסטלוגרפיה (MX) מספקים מקור אנרגיה tunable לנצל עקיפה חריגה מבנה הפתרון. בסעיף הבא, סדרת הוראות עבודה בקו אחד עם היכולות ניסיוני של יהלום אור מקור MX beamlines מוצע, אבל קווים מנחים אלה ניתן גם להתאים beamlines MX-synchrotrons אחרים ברחבי העולם. כשלב ראשון, זה שימושי לאשר או לזהות חריגות scatterers בגביש. זה תושג בנוחות על ידי מדידת ספקטרום קרינה פלואורסצנטית רנטגן של הגביש. תחילה ודא אנרגית הרנטגן הפרעות לקרן החלקיקים שוכן גבוה מספיק כדי לעורר כל האלמנטים בדרך כלל צפוי עבור גבישים macromolecular (14 קוו ומעלה). להשתמש בתוכנה שליטה הפרעות לקרן החלקיקים כדי לבחור את הדגימה כדי להיות מותקן על ידי הרובוט מחלף מדגם; הלולאה ימורכז אוטומטית בקרן רנטגן, מרכוז קריסטל יכול להיות מאושרות באופן ידני באמצעות תוכנת שליטה הפרעות לקרן החלקיקים. שיא של ספקטרום קרינה פלואורסצנטית רנטגן הפרעות לקרן החלקיקים שליטה בתוכנות: המשתמש בוחר את זמן החשיפה של ויוזמת המדידה (הגדרה ספקטרום קרינה פלואורסצנטית/פלורסצנטיות, → לרוץ, איור 2A). תוכנת שליטה הפרעות לקרן החלקיקים עמדות באופן אוטומטי את תצלום הרנטגן גלאי קרינה פלואורסצנטית ב מקום וקובע את האירוע המינימלי רנטגן השטף כדי לקבל אות הניתן לקריאה על גלאי קרינה פלואורסצנטית. הקשת רכשה ואז ניתוח באופן אוטומטי עם פסגות פליטה מותאם באופן טבעי רכיבים ביולוגיים. רוטינות אלה הינם זמינים במרחק הפרעות לקרן החלקיקים שליטה תוכנה ממשק משתמש גרפי (GUI) – GDA (www.opengda.org) על החברה שלנו ועל synchrotrons ברחבי אירופה 41 , 42. אם אלמנטים מתאימים מזוהים זה אפשר לנצל בשביל ניסוי עקיפה חריגה, לבצע בסריקה אנרגיה קצה של ספיגת רנטגן כדי לקבוע את אורך הגל האופטימלי עבור איסוף נתונים עקיפה חריגה מן הגביש: על הפרעות לקרן החלקיקים לשלוט תוכנה, בחר את הרכיב, ליזום את הסריקה (זריחה/זריחה לסרוק הגדרה, → שם אטום, → לרוץ, איור 2B). הערה: עבור ניסוי עקיפה חריג יחיד, הפסגה של הקצה הקליטה משמש כדי להגדיל את הפיזור חריגה. ניסיוני שיקולים לביצוע ניסוי עקיפה חריגה גל רב היה בעבר מפורט 43. כדי לקבוע את קריסטל יחידת התא בפרמטרים, סימטריה, מגבלת עקיפה, למדוד שלושה דפוסי קרני רנטגן במרווחי 45° בשיטת תנודה (אוסף נתונים/הקרנה → לרוץ הנוכחי, איור 2C). הפרעות לקרן החלקיקים בקרת התוכנה מספקת למשתמש בחירה של זווית תנודה זמן החשיפה, ואת היכולת להגדיר את השידור אחוז של קרן רנטגן. עבור הקרנה רגיל קריסטל, זווית תנודה של 0.5°, מועד החשיפה של 0.5 s, ו- 5% רנטגן קרן שידור מומלצים. תמונות דיפרקציה נמדד מנותחים באופן אוטומטי על-ידי הצבר עדנה ולחזור ערכה של אסטרטגיות עבור אוסף של נתונים מקיפה 22. רנטגן איסוף נתונים הערה: המשתמש יכול לבחור כדי לאסוף נתונים במצב תנודה רגיל או במצב קרן הפוך, המאפשרת פרידל החברים שיירשמו קרוב פעם והמנה רנטגן, ועם כ ההתנהגות הקליטה זהה המאפשר מדידה מדויקת יותר של הבדלים חריגה. האחרון הוא שימושי במיוחד אם צפויים הבדלים קטנים חריגה ו/או הדוגמאות הן קרינה רגיש בעת ביצוע ניסוי עקיפה חריגה. שיקולים על האסטרטגיות אוסף הנתונים הטוב ביותר לשימוש כבר באופן מקיף שנסקרה 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47. באמצעות תוכנת שליטה של הפרעות לקרן החלקיקים, לייבא את הפרמטרים אוסף נתונים כפי שהוצע על-ידי התוכנית אסטרטגיה אשר תספק: א מיקום התחלתי של הציר ω-סיבוב ii. רוחב תנודה ω-ציר הסיבוב זווית עבור כל תמונה עקיפה iii. זמן החשיפה עבור כל תמונה עקיפה הרביעי. מספר תמונות עבור dataset מלאה (הגדרת בעקיפין את זווית הסיבוב של ציר ω הכולל עבור אוסף הנתונים כולה) נ’ אחוז הנחתה של קרן רנטגן כדי למנוע נזק חשיפת יתר וקרינה הערה: במוסד שלנו, עבור פועל על איסוף המידע, הצינורות תוכנה לעיבוד אוטומטי של הנתונים שנאספו מבוססים היטב: (i) עקיפה נתונים מופחתים (אינדקס משולב, שקנה המידה שלה השתנה) על-ידי הצבר xia2, אשר יוצרת קבצים mtz השתקפות של המשתמש כקלט עבור פתרון/עידון בהדרגה ומבנה 48. (ii) כאשר אות חריגה משמעותית ומתגלה במהלך ניתוח נתונים, הראשון מבנה אוטומטית מהירה פתרון צינור (fast_ep) באמצעות SHELX מנסה לפתור את המבנה התחתי אטום כבד על ידי ניסיוני בהדרגה, מתן מפת צפיפות אלקטרונים מדורג איפה ריאלי. צינור השני מבנה מקיף יותר פתרון מתחייב באופן אוטומטי ניסיונות לפתור ולבנות את structure באמצעות תוכנה עצמאיים סוויטות 49 , 50 , 51 , 52; במקרים בהם זה מוצלח, המשתמש תסופק עם מפת צפיפות הראשונית של מודל, אלקטרונים. זה מספק את הבסיס עבור המשתמש להשלים עידון ולאימות הדגם עם הסוויטות התוכנה לחקר הגבישים של בחירה-

Representative Results

פרוטוקול משולב זה הוכח להיות מוצלח עם ארבעה (שניים לאור, שניים שלא פורסמו מבנים) של פחמימות 6 מחייב חלבון מטרות מן pneumococcus נותחו עד היום32,53. בחלק זה, אנו מציגים את אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 כתוצאה מכך נציג להנחות מחקרים מבנית של SBPs באופן כללי. לאחר כבר הביע SP0092 SBP, מטוהרים כפי שהוגדר בעבר32, חלבון מטוהרים נותחו ליציבות מאגר שימוש assay shift תרמי: SP0092 תערוכות של מוגברת Tm ב- pH 6.5 ובפני NaCl 0 – 0.2 מ’ טווח ריכוז (איור 3 א). לאור זאת, הפתרון מאגר עבור השלבים הבאים מוגדר כ: ז 0.02 נקודות MES pH 6.5, 0.2 מ’ NaCl, 2.5% (v/v) גליצרול, 0.5 מ מ TCEP. המסה טוחנת מוחלטת של ארצות oligomerization שונים של SP0092 נמדדה על ידי MALS מצמידים שניה מדידת משקל מולקולרי של 187.2, 140.8, 97.0 49.4 kDa, המתאים tetrameric, trimeric, dimeric ו monomeric מינים, בהתאמה ( איור 3B). ניתוח הנתונים של הפרופיל שניה-חלבונים שונים דילולים גילה כי oligomerization המופעלת על-ידי ריכוז חלבון מוגברת, רומז כי oligomers גדולים יותר הם יציבים יותר בריכוזים גבוהים מאשר המשמש בדרך כלל התגבשות. אכן, המין oligomeric גדול מטוהרים למזהים ייחודיים של התגבשות ניסויים, חלבון המיוצר בהצלחה קריסטלים תוך מונומר של מינים לא. הקריסטלים ממוטבת המתקבל הילידים, שכותרתו צורות של SP0092 Se-מתיונין התאפיינו קרני רנטגן. מדידה של פלואורסצנציה רנטגן של גבישים אלו חשף בשני המקרים פליטת פסגות עבור Zn המחויבות החלבון, בעוד Se זוהה רק עבור הקריסטלים Se-מתיונין כצפוי. מאוחר יותר, סריקות של הקליטה רנטגן בקצוות Se ו- Zn בוצעו, אשר סיפק מידע ניסויית ישירה לכוון את אורך הגל רנטגן התקרית לקצוות הקליטה רנטגן בהתאמה של Zn או Se נוכח הקריסטלים כדי למקסם את אות חריג השגה מתוך נתוני מערכת תוצאות (איור 4A–B). לאחר מדידה שלוש תבניות עקיפה שידור נמוכה, ערכת נתונים חריגה מלאה הושג באמצעות איסוף נתונים האסטרטגיה שהוצעה על ידי עדנה (איור 4C). האות חריגה הנוכחי מעורר את הצינור phasing אוטומטיות-הפרעות לקרן החלקיקים לקבוע את מבנה תת, בהתבסס על שלבי הניסוי הראשוני נגזר, מפיק ראשי תיבות מפות ודגמים, אשר לאחר מכן ניתן מעודן לאמת (איור 4D ). לסיכום, מוקשים פוטנציאליים של הטכניקה מרוכזים בעיקר על איכות וזמינות של קריסטל. אופטימיזציה של התנאים המאגר כדי לשפר את יציבות חלבון, כמו גם זיהוי של המדינה oligomeric המתאימים ביותר של החלבון לשימוש, כאשר אחד או יותר אוליגומר מזוהה בפתרון, יכולים להפחית את הסיכון של כשל ב התגבשויות שלב. ניצול השימוש מאוגד יונים מתכתיים לזהות בשלב מוקדם יכול להאיץ את מבנה הפתרון ולהימנע ייצור מיותרות של selenomethionine הנקרא חלבון כאשר שיטות מולקולרית החלפת נכשלים. איור 1. תרשים של זרימת עבודה עבור איפיון ביוכימי ומבניים של פחמימות SBPs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. באיור 2. אפיון קריסטל ב- GDA. צילום מסך של הכרטיסיה בקרת קרינה פלואורסצנטית רנטגן של תוכנת שליטה GDA הפרעות לקרן החלקיקים (A). צילום מסך של הכרטיסייה בקרת קצה-סריקה של אנרגיה קרני רנטגן ב- GDA (B). צילום מסך של הכרטיסיה ההקרנה קריסטל של אוסף נתונים ב- GDA (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3. איפיון ביוכימי של SP009239-491. (א) גרף תלת-ממד-פני התוויית את טמפרטורת ההיתוך של SP009239-491 כ פונקציה של רמת ה-pH וריכוז NaCl של הפתרון מאגר. תוצאות שניה (B) ו- MALS SP009239-491. הקליטה ב- 280 ננומטר מוצג בצבע כחול. ההמונים טוחנת של המדינות oligomerization שונים מוצגים באדום. לוח (B) שונה מ-32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. באיור 4. אפיון מבניים של SP009239-491. (א) (B) רנטגן ספיגת אנרגיה לסרוק בקצה Zn ו- Se עבור גבישים39-491 SP0092. קרינה פלואורסצנטית נמדד Zn, Se המכיל קריסטלים מוצג כחול, תכלת, האותיות המחושבים ‘ ו- f “פיזור חריגה שברים הם ירוק ואדום, בהתאמה. (ג) דוגמאות של קרני רנטגן דפוסי אסף מקריסטלים39-491 SP0092. (ד) קריקטורה ייצוג של מבנה דיימר39-491 SP0092. Protomer אחד בצבע אחר מגנטה (שאריות 39-366) ואת ויולט (שאריות 367-491), האטומים פיזור חריגה מוצגים כדורים כחולים, ציאן Zn, Se, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 0.1 M חומצה ציטרית pH 4.0 0.1 M חומצה ציטרית pH 4.5 0.1 M פוספט pH 5.0 0.1 M ציטראט pH 5.5 0.1 M Bis-טריס pH 6 0.1 מ’ עדה pH 6.5 0.1 M MOPS pH 7 0.1 M HEPES pH 7.5 0.1 M Imidazole pH 8.0 0.1 M טריס pH 8.5 0.1 pH צ’ז M 9 0.1 M צ’ז pH 9.5 NaCl 0 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0.1 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0.2 מ’ 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0.5 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL טבלה 1. מאגר הרכב עבור shift תרמי וזמינותו.

Discussion

בנייר זה, אנו מתארים ולאמת פרוטוקול משולב פלואורסנציה פחמימות SBPs עם דגש ספציפי על חלבונים מ ס pneumoniaeהביוכימי ומבניים. עם זאת, ניתן להשתמש בתור תהליך סטנדרטי לניתוח של אחרים SBPs של אורגניזמים שונים, אפילו חלבונים מסיסים שאינם קשורים אחרים.

החלק הראשון של הפרוטוקול מתמקדת המספקים מידע ביוכימי על מבנה רבעוני, אשר אפשר לנצל כהכנה החלבון דוגמאות של התגבשות והיציבות של חלבון. במקטע מבחני shift תרמי, נתאר רק את ה-pH ווריאציות NaCl ריכוז כדי לשמור על האופי הכללי של הליך זה. למרות זאת, תנאים מאגר רבים אחרים יכול להיבדק באופן דומה, לדוגמה, כולל כל תרכובת כימית משמשים תוסף המייצב: בפרט ligand(s) בפועל זה לאגד SBP ספציפי עובדים בצורה ניכרת להגדיל את ה-Tm על ידי מעלות צלזיוס מספר31. במקרים מסוימים, עקומות denaturing ניתן להגדיר בצורה גרועה עקב אות נמוכה או רקע זריחה גבוהה, אשר נגרמת על ידי צבירת חלבון או התגלגלות חלקית. כדי למנוע זאת, ניתן לבצע טיטור חלבון: צבע כדי למטב את עקומות denaturing לא ברור. אם אין שיפור מתקבל, הקרנת תוספים שונים יכולים לשפר את היציבות של החלבון מומלץ, מסכי מתאים היה שתואר לעיל54.

בדרך כלל, רוב SBPs monomeric בסביבתם הטבעית, אך כפי שמוצג כאן multimerization יכול להתרחש בריכוזים גבוהים המשמשים התגבשות ניסויים, ובכך אפיון התנהגות oligomerization שסופקו על-ידי MALS ושל שניה זה חיוני כדי להעריך את המדינה oligomerization monodisperse יציב מאהדה ביותר עבור התגבשות עם זאת, קשה לחזות את השפעת כימיקלים שונים הכלולים במצב של התגבשות ההתנהגות oligomerization של החלבונים. אם בבדיקה שניה ו- MALS מציגה את מצבור נרחב של המדגם חלבון, היינו ממליצים הבאות כדי להפחית את הסבירות של התרחשות מעין זו: להשתמש במדגם חלבון טרי (לא להקפיא-הקרת) ולהרחיב את הניתוח מייצב לבצע תרמית מבחני shift, בדיקות תוספי אפשרי, דטרגנטים קלים כמוצא אחרון, כדי למזער את מצבור. בנייר זה, אנו מציגים הנחיות בסיסיות התגבשות באמצעות הקרנה מסחרית התגבשות מטריצה דלילה תפוקה גבוהה כדי לשמור על האופי הכללי של פרוטוקול זה. עם זאת, קבלת גבישי חלבונים ברזולוציה גבוהה רנטגן עקיפה ייתכן שיהיה עליך כוונון עדין האיטראטיבי לייעל את התנאים התגבשות ביחס ריכוז precipitant, pH, תוספת של תוספים כימיים, טמפרטורות שונות, ו גורמים אחרים המשתנים dynamics שיווי משקל בין קריסטל טיפה, מאגר16,17.

החלק השני של הפרוטוקול מתאר את האפיון של הקריסטלים חלבון על מנת להגדיר את האסטרטגיה האופטימלית עבור איסוף נתונים של קרני רנטגן עם דגש ספציפי על רכישת נתונים חריגה עבור בהדרגה עצוב. גם אם SBPs לשמור על ארכיטקטורת כללי דומה (ישנם מבנים תלת-ממד הופקדו רבות שעשויות להיות שימושיות כמתחילה מודלים), בהדרגה החלבונים האלה בשיטת החלפת מולקולרית אינה תמיד פשוטה בגלל ההשתנות של רכיבי מבנה שניוני, הגמישות מהותי של חלבונים אלו. לפיכך, אנו מציעה שיטת עצוב, להדגיש כי חלבונים אלה עשויים כבר ממהותם אוחזים מתכות או איגוד אכן לא ספציפית של מתכות מן התנאים מאגר התגבשות, אשר יכול לספק מגוון רחב של רכיבים diffracting חריגה שלב רגיל בפרוטוקול הכללית שלנו.

לסיכום, פרוטוקול זה מגדיר זרימת עבודה מודרכת סטנדרטי של נהלים המאפשרים את תיאור מפורט של התכונות הביוכימי ומבניים של SBPs שעלולים להיות מנוצלים לרעה כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של נחישות המבנה, כמו גם להאיץ אפיון מבניים של SBPs באופן כללי.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו להכיר OPPF-UK לסיוע בשיבוט, ג’מה האריס שניה-קניונים, המדענים של beamlines I03, I04 במקור אור יהלום.

Materials

SelenoMethionine Medium Complete Molecular Dimensions MD12-500 Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.
MicroAmp Optical 96-Well plate Applied Biosystems 4306737 The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
SYPRO Orange Molecular Probes S6651 SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.
MicroAmp Optical Adhesive film Applied Biosystems 4311971 The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems 4362143 The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.
Superdex 200 increase 10/300 GL column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.
DAWN HELEOS II Wyatt DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.
Superdex 200 5/150 GL GE Healthcare 28906561 Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate MiTeGen XQ-P-24S-A The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.
PCT Pre-Crystallization Test Hampton HR2-140 The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 6098xx Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601 The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide – includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)
Standard Foam Dewar Molecular Dimensions MD7-35 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity.
Mounted CryoLoop – 20 micron Hampton HR4-955 Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607 This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway?. Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320 (2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Bergfors, T. . Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. , (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The “Venus’s-flytrap” model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD?. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357 (2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45 (2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection – current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777 (2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

Tags

Carbohydrate TransportSubstrate-binding ProteinStreptococcus PneumoniaeBiochemical CharacterizationStructural CharacterizationBuffer StabilityOligomerizationCrystallizationSize-exclusion ChromatographyMulti-angle Light ScatteringPre-crystallization TestingProtein ConcentrationCrystallization Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D. R., Walsh, M. A. Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092. J. Vis. Exp. (128), e56294, doi:10.3791/56294 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image