ライブ イメージング モニター細胞生物学および複数の神経集団の血統で、進行を追跡 1 つのセルに続いて

複数神経集団 (図 1) の単一細胞追跡続いてライブ イメージングを実行に必要な手順について説明します。含む動物このプロトコルで記述されている必要がありますすべてのプロシージャは、実験動物科学 (ICLAS) の国際評議会のガイドラインに従って実施。 図 1.すなわちプロシージャの主な実験手順を示すスキーム: 細胞培養、ライブ イメージング、PICC とデータ収集、追跡、1 つのセルと最終的な結果。手順は、プロトコルの作業フローに従って番号が付けられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 1. 細胞培養: 分離と神経集団または細胞系譜選択しためっき 注: このプロトコルと連携して、神経細胞の生物学を分析するその有用性を検証するための異なる細胞集団への応用の例が与えられます。これらが含まれます: (詳細な分離のプロトコルを参照してください14); の上衣ゾーン (SEZ) マウス由来成体神経幹細胞 (aNSCs)(詳細な分離のプロトコルを参照してください15); の神経細胞リプログラミング研究する皮質アストロ サイト生後(詳細な分離法を参照してください16); の小脳アストロ サイト生後マウス神経 2 a 神経芽細胞腫細胞株 (N2a)。 ポリ-D-リジン コーティング 24 ウェル プレートに直接細胞を播きます。ウェルあたり 1 mL の培地を使用します。プレート 37 ° C で 8% CO2 aNSCs、またはライブ イメージングの前に 2 h のアストロ サイト/セル行の CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。単一細胞を追跡が不可能となる coverslips 電動顕微鏡ステージを転置した不必要な動きを防ぐために使用しないでください。注: セル密度と培地、実験で用いられた、: 30-40,000 細胞/ウェル ダルベッコの aNSCs のためのイーグル培地 (DMEM:F12 栄養混合物媒体) を更新N2a DMEM 高グルコース培地で細胞の 20,000 細胞/ウェル、80,000 細胞/ウェル DMEM 高グルコース培地; で小脳のアストロ サイトの55 65,000 細胞/ウェル DMEM:F12 栄養混合物中で生後アストロ サイトの。 実行可能なセルの最低数に文化の細胞密度を調整することによって文化プロトコルを標準化します。それにもかかわらず、細胞密度は、文化の生存を維持するために十分に高い必要があります。注: セル密度が高すぎる場合、余分な破片や貧しい解離 (塊) を妨げる単一細胞の追跡。 2. ライブ タイムラプス ビデオ顕微鏡によるイメージング 顕微鏡、カメラ、ハードウェア、およびインキュベーション システムをオンにします。温度を設定し、空気圧 aNSCs のための 37 ° C と 8% の CO2アストロ サイト/セルラインの 37 ° C および 5% の CO2 。温度と CO2のレベル 1-2 h を安定させるために許可します。メモ: 特定の機器が時間経過のビデオ分析を実行する必要を含む: 電動コンポーネントと明るいフィールド/位相差/蛍光顕微鏡温度、CO2と湿度の制御培養装置そして最後に、信頼性が高く、十分に強力なハードウェアとソフトウェアを取得して写真のボリュームを処理できるライブ イメージング実験 (材料の表をご確認ください) の間に得られました。 セルはしっかり、プレート (めっき後 2 h) に取り付けられている、一度は、追跡、すなわち細胞が含まれていない井戸は使用されません 1 つの井戸の底に小さなマークを作成するのに永久的なマーカー ペンを使用します。注: このマークとして使用されます参照 xyz 座標をゼロと中に実験の後またはゼロの位置に戻るには、媒体の変化の間、いつでも使用できます。 顕微鏡の培養室内プレートを置き、変位顕微鏡の電動ステージの中にすべての不必要な動きを避けるためにステージにプレートにしっかりと取り付けます。 約 20 分の商工会議所で平衡に細胞培養液の温度を許可します。この手順はコンポーネントの拡張によって録音中の焦点の損失を避けます。 ライブ イメージング ソフトウェアを起動し、実験を設定するタイムラプス モジュールを選択します。 「タイム スケジュール タブ メニュー」で実験と画像取得サイクルの合計時間を設定します。送信された固有の毒性または使用される蛍光ライトのため、解析の時間分解能と潜在的な細胞死のバランスを十分な間隔を定義します。注: たとえば、120 h の合計が aNSC 文化、明視野画像 5 分毎にこの構成では 1 つのムービーの 120 h の買収が 120-150 ギガバイトのコンピューター デバイスの空き領域を要求する検討を取得しました。 X と y 座標、および「xyz ポイント タブ メニュー」で焦点距離 (z 座標) によって定義される画像位置を選択します。いつでも、座標を取得するために初期位置として基準点 (xyz 0 座標) を含めます。 または必要なとき落射蛍光励起との組み合わせでのみ「波長選択タブ メニュー」、明視野での取得資産種類を選択します。露光時間を選択します。念頭に送信、露出と (前述)、特に蛍光灯の光はセル実行可能性を損ないます。 ANSCs、小脳のアストロ サイトおよび N2a セル、明視野 (10-50 ms 露光時間) を選択します。 赤/緑の蛍光で導入された皮質アストロ サイトが組み合わせで明視野 (10-50 ms 露光時間) を選択するの実験用の記者によって (赤色励起波長: 550 nm、400 ms 露出時間; 緑励起波長: 460-500 nm と 100 ms 露光時間)。 実験と画像を保存するフォルダーの名前を定義します。いつでも実験をリロードする位置のリストを保存し、すべての条件を設定すると、「今すぐ実行」ボタンをクリックしてしてテストを実行します。 実験を一時停止し、再実験が完了するまでは 1 日 1 回「z ボタンを上書きする」をクリックするとフォーカス条件を調整します。ライブ イメージング中に媒体の変更が必要な場合は、実験を一時停止し、時間経過室からプレートを取得します。次に、無菌条件の下で媒体を変更し、ステージにバック プレートを置き (手順 2.3 を参照してください)。再フォーカス条件を調整し、実験を再開します。注: を細胞死や過剰増殖培地の pH の変化だけでなく、部屋の温度の変化細胞の顕微鏡の正しい焦点を当ててあります。(ANSCs) などの重要な文化は、4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) を添加した培地の使用をお勧めします (最終濃度: 1 mM)。 3. ポスト画像各種 (PICC)、データの収集と処理 実験が完了すると、ソフトウェアを一時停止し、次の手順で説明するように、PICC と固定用プレートを取得します。 セル固定を実行: 1 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒド (PFA) (PBS の 4%) を 500 μ l 添加室温 (RT) で 10 分間インキュベートします。注意: パラホルムアルデヒド強い定着剤は、皮膚や目に触れないように慎重に処理する必要があります。ヒューム フードの内部でのみ操作する必要があります。 3 回で 1 mL の PBS セルを洗ってブロッキング液 (PBS ウシ血清アルブミン (BSA) の 2% (重量/巻) および非イオン性界面活性剤の 0.2% (巻/巻) を含む) を 500 μ l 添加します。室温 1 時間インキュベートします。 ブロックのソリューションを削除し、一次抗体溶液 250-400 μ L を追加します。室温 2 時間インキュベートします。一次抗体のソリューションには、BSA の 2% (重量/巻) および非イオン性界面活性剤の 0.2% (巻/巻) を含む PBS で希釈した一次抗体が含まれています。ここで説明した実験で使用される抗体: GFAP (1: 500) βIII-チューブリン (1:1, 000) と α-チューブリン (1:1, 000)。井戸に直接実施しています、大量のソリューションが必要とされるすべてのセルをカバーするため (250-400 μ L)。 3 回 1 mL の PBS で洗浄し、(手順 3.4 に記載された希釈) 二次抗体溶液 250-400 μ L を追加します。ここで説明した実験で使用される二次抗体: 抗マウス フルオレセイン (FITC) (1:800)、抗家兎 Cy3 (1: 500)。暗闇の中で常温 1 時間孵化させなさい。 3 回 1 mL の PBS で洗浄します。セルを 1 mL の PBS、プロトコルの後のステップにしてください。 顕微鏡ステージに戻ったプレートを置き、しっかりと電動顕微鏡ステージの変位の間に不必要な動きを避けるためにステージに結び付けます。 手順 2.2 で作成したマークを使用してゼロ位置 xyz を取得し、「すべての X、Y、Z オフセット」ボタンを押すことによってこの基準点に位置を再設定します。各位置のための焦点距離を再設定します。 「波長選択タブ メニュー」の蛍光性放出に必要な条件を構成する画像の最終ラウンドを取得以前 PICC の標的抗原を検出するために。 簡単に言えば、明視野、に加えて FITC をアクティブ (励起: 495 nm)、Cy3 (励起: 550 nm) ソフトウェアの取得オプション。明視野 400 ms 露出のための 10-50 ms を使用して、フルオロを検出および写真の最終ラウンドを取得する、「1 時間ループ」ボタンを押します。注: 蛍光性の強度は PICC 結果に応じて異なる場合があります。最適な画質を得るために露光時間を調整します。 ソフトウェアのファイル/エクスポート オプションを選択し、タグ付きイメージ ファイルの形式 (Tiff) または共同写真専門家グループ (Jpeg) 形式の画像を事前に定義された保存先のフォルダーにエクスポートします。 トラッキング ソフトウェアで必要な形式にエクスポートする画像変換: 追跡ツールは、17 (tTt)。これを達成するため、入力を定義、出力位置 (xy)、チャンネル (c) 時点 (t) に使用されるマーカーと同様に、ウィンドウの動作「tTt コンバーター ツール」のフォルダーと「画像に変換」ボタンを押します。注: 特定の設定に従って画像の名前を変更する必要があります、これらの実験で使用される各位置の個々 のフォルダーに格納する必要があります。要件、インストールについてはダウンロード可能、ポジション/イメージ、および追跡ツールの使用の名前を変更する: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html。 4. 単一セルのトラッキング データの名前を変更後、tTt ソフトウェアを実行します。ユーザー名と tTt 作業用のフォルダーを選択します。注: 追跡分析されたすべてのデータとエクスポートされた結果、ツール作業フォルダーが格納されます。作業フォルダーは、tTtexport、「AVIexport」、「構成」、”TreeExport”、”tTtfiles”という名前サブフォルダーを含む名前必要があります。 実験が格納されているフォルダーのパスを示す「選択実験フォルダー ウィンドウ」で読み込まれる実験を選択し、「実験をロード」ボタンをクリックしますします。 読み込まれているイメージをトラッキング ソフトウェアで読むことができる形式に変換するログ ファイル コンバーターを実行 (実験が最初に読み込まれる、ためこれから要求される自動的にソフトウェア)。 (後に変換、実験中に記録された位置の概要は、「位置レイアウト ウィンドウ」に表示されます)、そのシンボルをクリックしてして追跡するための位置を選択します。各位置、位置と対応する番号の画像で構成されるシンボルによって表されます (図 1参照)。 位置が選択されているし、「位置レイアウト ウィンドウ」の右側に利用可能なイメージの一覧を表示、選択し、「画像を読み込む」ボタンをクリックして。 読み込みが完了し、「セルのエディター ウィンドウ」が表示されます波長と「セル エディター ウィンドウ」内で追跡するイメージ間隔を選択します。明視野観察に対応する波長 0、1 は FITC、Cy3 に 2 に対応、DAPI を 3。ここで説明する実験、インターバル 1 が使用された、すなわち、すべての画像が読み込まれます。明確にするには、は、間隔 2 は、すべての 2 番目のイメージの読み込みを意味します。 画像が読み込まれると、「位置レイアウト ウィンドウ」に戻るし、以前に読み込まれた位置を表すアイコンをダブルクリックします。実行する単一セルのトラッキングを可能にする「映画の窓」が表示されます。 追跡ツールの指示に従って、追跡に進みます。(明視野観察に対応する) 0 チャンネルを選択し、明るさとコントラスト (「調整ガンマ ボタン」) を調整します。追跡を起動するには、F2 キーを押します。注: 追跡、時に追跡対象のセルが続きますにマウス ポインターを置くと、「0」キーを押します。細胞分裂、細胞のアポトーシスおよび失われたセルのボタンはこれらの特定のセルのイベントを監視することがあります。として実験を追跡すると、これらの各オプションは自動的に実験が追跡されているように「セル エディター ウィンドウ」に描かれた系列ツリーに表示されるが。 クローンを追跡すると、一度細胞の子孫の性質を識別する PICC によって得られた蛍光画像を明視野画像と一致します。「映画の窓」で表される各落射蛍光チャネル (チャネル 1、2、など). 5. 最終的な結果 単一細胞トラッキングが完了すると、識別、子孫保存実験 (セル エディター ウィンドウ/ファイル] タブ/として現在のツリーを保存) し、結果をエクスポートするのに進みます。 系統樹と「セル エディター ウィンドウ」にある「エクスポート メニュー」内のセル データをエクスポートします。同様に、エクスポート セル画像と「エクスポート メニュー」を介して映画を「映画の窓」からアクセスできます。画像、リネージュの木、データ、および映画は、tTt の作業フォルダーにエクスポートされます。