Ein robustes Protokoll zum neuronalen Populationen von Time-Lapse Video-Mikroskopie, gefolgt von Post-Processing Software-basierte Überwachung wird beschrieben. Diese Methode stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur biologischen Ereignisse in einer ausgewählten Population während live-imaging-Experimente zu identifizieren.
Das Verständnis der Mechanismen, die wichtige biologische Gefahrenlagen neuronale Zellpopulationen wie Proliferation, Differenzierung oder Zelle Schicksal Entscheidungen steuern wird für therapeutische Designstrategien für viele Krankheiten, die das Nervensystem entscheidend sein. Aktuelle Methoden zur Zell-Populationen verfolgen verlassen sich auf ihre endgültigen Ergebnisse in Standbildern und sie in der Regel keine ausreichenden zeitlichen Auflösung, verhaltensbezogene Merkmale in einzelnen Zellen zu identifizieren. Darüber hinaus Abweichungen in Zelltod, Verhaltensstörungen Heterogenität innerhalb einer Zellpopulation, Verdünnung, Verbreitung oder die geringe Effizienz der Marker verwendet, um Zellen zu analysieren sind alle wichtigen Handicaps, die unvollständig oder nicht korrekt auslesen der Ergebnisse führen wird. Umgekehrt stellt die Durchführung live Imaging und einzelne Zelle Verfolgung unter geeigneten Bedingungen ein mächtiges Werkzeug für jedes dieser Ereignisse zu überwachen. Hier wird ein Time-Lapse Video-Mikroskopie-Protokoll, gefolgt von Post-Processing, beschrieben, um neuronale Populationen mit einer einzelnen Zelle Auflösung, Einsatz von spezifischen Software zu verfolgen. Die beschriebenen Methoden können Forscher zu wesentlichen Fragen der Zelle Biologie und Linie Fortschreiten der unterschiedlichen neuronalen Populationen richten.
Um neue und effektivere therapeutische Strategien zur neuronalen Populationen regenerieren zu entwickeln, müssen wir zuerst die grundlegenden Mechanismen verstehen, die Zellen mit einem regenerativen neuronale Potenzial zu pflegen. Dieses Ziel zu verfolgen, erfordert ein umfassendes Wissen über die Faktoren, die die Balance zwischen Ruhe, Verbreitung/Differenzierung, der Modus und Zeitpunkt der Teilung, Zellzyklus Länge, wandernde Kapazitäten, Lebensfähigkeitzu regulieren. Obwohl es einen technischen Ansatz, der viele Jahre1beschäftigt war ist, Leben Bildgebung und direkter Beobachtung bleiben immer noch die beste Option, um den oben aufgeführten Ereignissen überwachen. Im Gegensatz zu vielen anderen Ansätzen zentriert auf Endpunkt Auslesen live imaging und Einzelzelle tracking liefern Informationen über die gesamte Länge von einem Experiment2,3,4,5, 6. damit, die Zugabe von zeitlicher Auflösung ermöglicht Zelltod, heterogene Zelle Verhalten oder Zelle Schicksal Entscheidungen, sowie viele andere kritische Ereignisse identifiziert werden, die sonst passieren könnte unbemerkt. Im Idealfall sollten diese Funktionen von Zellen am besten auf die einzelne Zelle Ebene in vivo überwacht werden wo beide intrinsische (Zelle autonome) und extrinsische (Zelle Nischen-) Hinweise berücksichtigt werden.
Jedoch obwohl in der in-vitro- Situation Ereignisse in einer Umgebung, die das natürliche Milieu nicht reproduziert auftreten, die Low-Density Kulturbedingungen, die in der Regel in diesen Protokollen verwendet eignen sich eher intrinsische Eigenschaften zeigen die Zellen. Darüber hinaus kann eine einfache Steuerung des umgebenden Milieus, indem Sie ändern einfach das Wachstumsmedium darstellen ein wertvolles Werkzeug, um die individuelle Rolle jedes extrinsischer Faktor, der die neuronale Nische definiert sowie Umweltfaktoren, die möglicherweise zu untersuchen in pathologischen Szenarien7,8,9,10,11,12,13induziert werden. Daher, wenn richtig konfiguriert, wie im Protokoll, die hier vorgeschlagenen, bietet live Imaging machbar in-vitro- Lösung um die meisten der zuvor aufgeführten Fragen befassen.
Dieses Protokoll beschreibt in Kürze die Hardware, Software, Kulturbedingungen und die wichtigsten Schritte erforderlich, um ein live-imaging Experiment gefolgt von einzelligen tracking erfolgreich auszuführen. Dieser Ansatz bietet wertvolle Informationen, die hilft, um wesentliche Aspekte der Biologie und der Abstammung Progression, mehrere neuronalen Populationen zu offenbaren.
Einer der wichtigsten Werte der live Bildgebung ist die Möglichkeit, genaue Abstammung Ablaufverfolgung, verdeutlichend kritische Aspekte der Linie Fortschreiten in einer neuronalen Population durchzuführen. Linie die Ablaufverfolgung ist definiert als die Identifizierung und Überwachung der Nachkommen von einem einzigen Stammvater, des Gründers des Klons auf die anschließende Klon gebildet21. Bemerkenswert ist, haben alternative Methoden für Linie verfolgen (z.B., virale Transduktion oder multicolor Reporter Konstrukte21) einen kritischeren Nachteil, wobei das Endergebnis basiert auf unbewegten Bildern und es muss nicht zwangsläufig die gesamte Sequenz dar. Dies bedeutet, dass Zelltod, Heterogenität im Verhalten der Zellpopulation, Verdünnung, Verbreitung oder schlechte Effizienz der Marker, zusammen mit anderen wichtigen Nachteilen, unvollständig oder nicht korrekt auslesen der Ergebnisse2führen. Darüber hinaus ermöglicht live Bildgebung den Forscher zu analysieren, wichtige Merkmale der Biologie der neuronalen Populationen, z. B. den Modus und den Zeitpunkt der Zellteilung, Zellwachstum, Migration, Verbreitung versus Differenzierung, Zellzyklus Länge, Neurit Bildung, Komplexität und Länge, Zelle Schicksal Auswahl (Differenzierung) oder Umwandlung (Umprogrammierung).
Darüber hinaus live Imaging kann leicht mit anderen Analyse sollen Daten aus einzelnen Zellen wie z. B. ergänzt werden RNA-Sequenzierung. Um die Vorteile von live Imaging und andere Techniken zu erreichen erfordert jedoch, dass jene Zellen, die bisher in den Filmen überwacht sind später wieder erkannt und individuell für die Sekundäranalyse gesammelt. Dies kann erreicht werden durch den Einsatz von Mikroskopen, die positionale-Koordinaten enthalten, durch die Anwendung von fluoreszierenden Reporter für bestimmte Zellen oder Analyse der Verteilung der Gruppen von Zellen als Referenzen. In der Tat können die Kombination aus das Transkriptom-Profil und Verhalten der einzelnen Zellen eine leistungsstarke Route, neue molekulare Signale an die Biologie der Zellen beteiligt aufzuklären darstellen.
Eines der wichtigsten Probleme, die eine live-Image Experiment gefährden können ist eine unzureichende Zelldichte Kultur. Wie bereits erwähnt, am high-Density beeinträchtigen der Überschuss an Schutt oder schlechte Dissoziation (Büschel-Formation) die Qualität und die räumliche Auflösung der Bilder, einzelne Zelle tracking undurchführbar machen. Daher sollte die niedrigste Zahl der Zellen möglich die Bedingungen für die unterschiedlichen Zellpopulationen unter Studie angepasst werden, ohne die Lebensfähigkeit der Zellkultur.
Die Häufigkeit der Bildaufnahme ist auch entscheidend und sollte sorgfältig eingestellt werden, besonders wenn Fluoreszenz Beleuchtung verwendet wird. Überbelichtung zu übertragen und vor allem Fluoreszenzlicht Zellviabilität beeinträchtigen. Alternativ kann eine übermäßige Verzögerung zwischen der Aufnahme der Bilder die zeitliche Auflösung der Analyse beeinträchtigen.
Ein weiterer wichtiger Schritt während der live-imaging Experiment ist die regelmäßige Anpassung der Fokussierung. Fehler in der korrekten Einstellung/re-einstellen von der Brennweite kann einzelne Zelle Tracking behindern. Darüber hinaus ist es notwendig, sorgfältig zu prüfen, dass die Inkubationszeit Kammer bewahrt die angemessene Temperatur, Feuchtigkeit und CO2 -Konzentration, Änderung der unerwünschte Veränderungen, die Zelltod induzieren können.
Schließlich, nachdem die PICC durchgeführt worden ist, ist es wichtig, richtig Xyz Null-Position vor der letzten Runde der Bildaufnahme abrufen. Nicht korrekt re-Einstellung des Xyz Nullstellung wird entsprechend der Phasenkontrast- und Immunfluoreszenz Bilder, behindern die Identifizierung der Zelle Nachkommen erschweren.
Obwohl dieser Ansatz viele positive Facetten hat, bestehen einige Einschränkungen für die live Bildgebung der neuronalen Populationen noch. Zum Beispiel macht die geringe Zelldichte erforderlich, um erfolgreiche Einzelzelle Verfolgung von aNSCs durchführen es unmöglich, biochemische Tests wie Western Blot-14zu beschäftigen. Darüber hinaus Überwachung Populationen schnell teilen wie zerebelläre Astrozyten oder N2a Zellen ist zeitlich beschränkt, wie es oft zu schwer für die Verfolgung von Zellen als die Kulturen in der Nähe von Confluence. Darüber hinaus beeinträchtigen viele Kulturmethoden sowie die inhärenten biologische Einschränkungen mit der Isolierung von Zellen, oft Zellviabilität über lange Zeiträume, Begrenzung der Dauer der live-imaging-Experimente. Schließlich hat die Zellen aus ihrer natürlichen Umgebung zu isolieren, sowohl positive als auch negative Auswirkungen. Zellen, die isoliert von ihren physiologischen Nische können fehlschlagen, wichtige Signale zu empfangen, die ihr Verhalten modulieren während gleichzeitig stellt es ein mächtiges Mittel, um die Wirkung der diese Signale einzeln in die Linie Fortschreiten der spezifischen neuronalen testen Populationen.
Angesichts der oben beschriebenen Einschränkungen, ist es klar, dass das perfekte methodische Szenario wäre live imaging und einzelne Zelle Tracking unter normalen physiologischen Bedingungen in VivoExperimente. Aktuelle Techniken sind jedoch nicht in der Lage, einzelne Zellen für längere Zeit in tiefen Regionen des Gehirns2folgen. Daher sollten die Zukunft von live Imaging konzentrieren überwinden diese Einschränkung, mit dem Ziel, die Zellbiologie der einzelnen Zellen in Vivo mit den meisten kleineren Störungen der physiologischen Umwelt3vollständig zu analysieren.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken für ihre Unterstützung und Werk in Abbildung 1Beatriz Gascon. Wir danken Dr. C. Norris für seine Hilfe. Die hier vorgestellte Arbeit wurde unterstützt von Forschungsstipendien, “Red de Shmeissani Consolider Ingenio Spanisch Ionenkanal-Initiative” (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE-CM (S2013/ICE-2958), UCM-Santander (PR26/16-18 b-3) und Fundación Ramon Areces Grant Program (PR2018/16-02). Felipe Ortega erkennt Ramon y Cajal Programm des spanischen Ministeriums für Wirtschaft und die Wettbewerbsfähigkeit (MEC: RYC-2013-13290).
Poly-D-lysine | Sigma | P0899 | Working solution 0.02 mg mL-1 |
24 wells plate | Falcon | 352047 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) | Invitrogen | 21331-020 | |
DMEM High Glucose medium | Sigma | D6546 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003 | |
Triton X-100 | Merck | 11869 | non-ionic surfactant |
Mouse anti-β III Tubulin | Sigma | T8660 | |
Rabbit anti-GFAP | DakoCytomation | Z0334 | |
Mouse anti-α Tubulin | Sigma | T5168 | |
Anti-Mouse FITC | Jackson Laboratories | 715-095-150 | |
Anti-Rabbit Cy3 | Jackson Laboratories | 711-165-152 | |
Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope | Nikon | TE-2000-E | |
CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives | Nikon | Ref 280MRH10101 | |
CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives | Nikon | Ref 280MRH48230 | |
pE-300 LED fluorescence | Cool LED | Ref Number 1981 | |
310M-201 Incubation system (temperature) | OKO-Lab | Serial Nº VOF007307 | |
Pro-ScanII Motorized stage system | Prior | Serial Nº 60018 | |
High precision microscope camera version 4.2 | ANDOR Zyla | VSC-03650 | |
Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 | Nikon | NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E | |
OKO touch Incubation system (CO2) | OKO-lab | Serial number 1716 | |
Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line | ATCC | ATCCCCL131 | |
HEPES buffer solution 1 M | Invitrogen | 15630-056 |