活体影像随访单细胞追踪监测细胞生物学及多神经种群的谱系进展

以下各节描述了执行实时成像所需的步骤, 后跟多个神经群的单细胞跟踪 (图 1)。所有涉及本议定书所述动物的程序必须按照国际实验动物科学理事会 (委员会) 的指导方针进行。 图 1.方案说明了该程序的主要实验步骤,即: 细胞培养、活体成像、PICC 和数据收集、单细胞跟踪和最终结果。这些步骤根据协议的工作流程进行编号。请单击此处查看此图的较大版本. 1. 细胞培养: 分离和电镀选定的神经人口或细胞谱系 注意: 结合该协议, 给出了它在不同细胞群中应用的例子, 以验证其对神经细胞生物学特性的分析。这些包括: 从小鼠下区 (特区) 获得的成体神经干细胞 (aNSCs) (对于详细的隔离协议, 请参见14);产后皮质星形胶质细胞研究神经元重编程 (对于详细的隔离协议, 请参见15);产后小脑星形胶质细胞 (详细的隔离方法参见16);和小鼠 Neuro-2a 神经母细胞系 (N2a)。 种子细胞直接在聚 d-赖氨酸涂层 24-井板。每井使用1毫升培养基。孵育板在37° c 和 8% co2为 aNSCs, 或在37° c 和 5% co2为星形胶质细胞或电池线为 2 h 在活成像之前。避免使用片, 以防止不受欢迎的运动, 因为机动显微镜阶段是流离失所, 使单细胞跟踪不可行。注: 在实验中使用的细胞密度和培养基有: 30-40,000 细胞/良好的 aNSCs 在 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM:F12 营养混合物培养基);2万细胞/良好的 N2a 细胞在 DMEM 高糖培养基, 8万细胞/井小脑星形胶质细胞在 DMEM 高糖培养基;和55-65,000 细胞/良好的 DMEM:F12 营养混合物培养基中的出生后星形细胞。 通过将培养基的细胞密度调整到最低的细胞数量, 使培养方案标准化。然而, 细胞密度必须足够高, 以维持文化的生存能力。注意: 如果细胞密度太高, 多余的碎片或不太好的离解 (团簇) 可能会阻碍单个细胞的跟踪。 2. 实时视频显微成像 打开显微镜、照相机、硬件和孵化系统。设置温度和气压为37° c 和 8% co2为 aNSCs, 或到37° c 和 5% co2为星形胶质细胞或电池线。允许温度和 CO2级别稳定1-2 小时。注: 需要特定设备进行延时视频分析, 包括: 明亮的现场/相位对比/荧光显微镜与机动元件;控制温度的孵化装置, CO2和湿度;最后, 可靠和足够强大的硬件和软件能够获取和处理在现场成像实验中获得的图片量 (请检查材料表)。 一旦细胞牢牢地附着在盘子上 (电镀后2小时), 使用永久性的记号笔在一个井的底部做一个小的标记, 它不会被用于跟踪,也就是说,一个不包含单元格的井。注: 此标记将用作对 xyz 坐标零点的引用, 并且可以在实验期间或之后的任何时间使用, 或在介质的变化之间, 返回到零位置。 把盘子放在显微镜的孵化室里, 并将盘子牢牢地贴在舞台上, 以避免在显微镜的机动阶段移位时发生任何不受欢迎的运动。 允许细胞培养基的温度平衡在腔内大约20分钟。由于组件的膨胀, 此步骤将避免在录制过程中失去焦点。 启动实时图像软件并选择延时模块来设置实验。 在 “时间表标签菜单” 中设置实验的总持续时间和图像采集周期。由于所使用的透射或荧光光的固有光, 在分析的时间分辨率和潜在的细胞死亡之间确定一个适当的时间间隔来平衡。注: 例如, 总共 120 h 被选择了为新文化, 获取明图片每 5 min. 认为在该配置中获取单个电影的 120 h 将需要在计算机设备中有 120-150 gb 的可用存储空间。 在 “xyz 点” 选项卡菜单中, 选择由 x 和 y 坐标定义的图像位置和焦点距离 (z 坐标)。将参考点 (xyz 零坐标) 作为初始位置, 以便在任何时候检索坐标。 选择 “波长选择选项卡菜单” 中的购置类型, 仅明或在需要时与荧光励磁结合使用。选择曝光时间。记住, 过度的传播, 特别是荧光灯, 可能危及细胞的生存能力 (如上所述)。 对于 aNSCs, 小脑星形胶质细胞和 N2a, 选择明 (10-50 毫秒曝光时间)。 对于转皮质星形胶质细胞选择明 (10-50 ms 曝光时间) 结合红色/绿色荧光, 根据记者使用的实验 (红色激发波长: 550 nm 和400毫秒曝光时间; 绿色励磁波长: 460-500 nm 和100毫秒曝光时间)。 定义实验的名称和将存储图像的文件夹。保存位置列表以在任何时间重新加载实验, 一旦设置了所有条件, 请单击 “立即运行” 按钮运行实验。 暂停实验并重新调整焦点条件, 每天单击一次 “覆盖 z 按钮”, 直到实验完成。如果在现场成像过程中需要改变介质, 请暂停实验并从时间间隔内取出板。接下来, 在无菌条件下改变培养基, 并将板材放回舞台 (见步骤 2.3)。重新调整焦点条件并恢复实验。注意: 由于细胞死亡或繁衍, 以及室温的变化, pH 值的变化可能会影响显微镜对细胞的正确聚焦。对于敏感的文化 (如 aNSCs), 我们建议使用培养基补充 4-(2-羟乙基)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) (最终浓度: 1 毫米)。 3. 后成像免疫细胞化学 (PICC), 数据收集和处理 一旦实验完成, 暂停软件和检索板的固定和 PICC, 如下所述的步骤。 执行细胞固定: 用1毫升磷酸酯缓冲盐水 (pbs) 冲洗细胞一次, 并添加500µL 甲醛 (4% 在 pbs), 孵化10分钟室温 (RT)。注意: 甲醛是一种强力固定剂, 应小心轻放, 避免与皮肤或眼睛接触。它必须只在通风罩内操作。 用1毫升 pbs 洗涤细胞三次, 并添加500µL 的阻断溶液 (pbs 含有 2% (重量/卷) 的牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.2% (卷/卷) 的非离子表面活性剂)。在 RT 处孵育1小时。 移除阻塞解决方案并添加250-400 µL 主抗体溶液。在 RT 处孵育2小时。主要抗体溶液含有在 PBS 中稀释的主要抗体, 其中含有 BSA 的 2% (重量/卷) 和非离子表面活性剂的 0.2% (卷/卷)。在这里所描述的实验中使用的抗体: 胶质纤维 (1:500), βIII-蛋白 (1:1, 000) 和α-蛋白 (1:1, 000)。由于这是直接在井中进行, 需要更大的体积的解决方案 (250-400 µL), 以覆盖所有的细胞。 洗涤三次与1毫升 PBS 和增加250-400 µL 的二次抗体溶液 (稀释如步骤3.4 所述)。二次抗体用于在这里描述的实验: 抗鼠荧光素 (FITC) (1:800), 抗兔 Cy3 (1:500)。在黑暗中孵育1小时。 在 PBS 1 毫升中洗涤三次。将1毫升的 PBS 中的细胞保存在协议的后续步骤中。 将板放回显微镜阶段, 并将其牢固地附着在舞台上, 以避免在机动显微镜阶段的位移过程中不受欢迎的运动。 使用步骤2.2 中所做的标记检索 xyz 零位置, 并通过按 “偏移所有 X、Y、Z” 按钮将位置重新定位到此参考点。重新设定每个位置的焦距。 获取最后一轮图像, 配置在 “波长选择标签菜单” 中荧光发射所需的条件, 以检测以前在 PICC 中针对的抗原。 简要地, 除明之外, 激活 FITC (励磁: 495 毫微米) 和 Cy3 (励磁: 550 毫微米) 承购选择在软件。使用 10-50 ms 为明 400 ms 曝光检测荧光和按 “1 时间循环” 按钮, 获得最后一轮的图片。注意: 荧光强度可能因 PICC 的结果而异。调整展会时间, 以获得最佳的图像质量。 选择软件的 “文件/导出” 选项, 然后将带标记的图像文件格式 (Tiff) 或联合图像专家组格式 (Jpeg) 中的图片导出到预定义的目标文件夹。 将导出的图像转换为跟踪软件所需的格式: 跟踪工具17 (tTt)。要实现这一点, 请在 “tTt 转换器工具” 操作窗口中定义输入和输出文件夹, 以及用于位置 (xy)、通道 (c) 和时点 (t) 的标记, 然后按 “转换图像” 按钮。注意: 图像必须按照特定的设置进行重命名, 并且它们必须存储在单个文件夹中, 用于实验中使用的每个位置。有关安装、要求、重命名位置/图像以及使用跟踪工具的说明, 可在以下站点下载: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html。 4. 单细胞跟踪 重命名数据后, 运行 tTt 软件。选择用户名和 tTt 工作文件夹。注意: “跟踪工具” 工作文件夹将保存所有分析的数据和导出的结果。工作文件夹必须命名为 tTtexport, 其中包含名为 “AVIexport”、”配置”、”TreeExport” 和 “tTtfiles” 的子文件夹。 选择要在 “选择实验文件夹窗口” 中加载的实验, 指示存储实验的文件夹路径, 然后单击 “负载实验” 按钮。 运行日志文件转换器以将加载的图像转换为可由跟踪软件读取的格式 (对于第一次加载的实验, 该软件将自动请求)。 通过单击其符号来选择要跟踪的位置 (转换后, 在实验过程中记录的位置的概览将显示在 “位置布局窗口” 中)。每个位置将由一个符号组成, 其中包含位置的图片及其相应的数字 (请参见图 1)。 一旦选择了位置, 并在 “位置布局” 窗口的右侧显示了可用图像的列表, 请选择它们并单击 “加载图像” 按钮。 加载完成后, 出现 “单元格编辑器窗口”, 选择要在 “单元格编辑器” 窗口中跟踪的波长和图像间隔。波长0对应于明, 1 对应于 FITC, 2 至 Cy3, 3 至 DAPI。在这里描述的实验中, 使用了间隔 1,即, 所有加载的图像。为了澄清, 间隔2意味着每秒图像的加载。 加载图像后, 返回到 “位置布局” 窗口, 然后双击表示先前加载位置的图标。将出现 “影片窗口”, 允许执行单个单元格跟踪。 跟踪工具说明后, 继续跟踪。选择0通道 (对应于明), 并调整亮度和对比度 (“调整伽玛按钮”)。按 F2 键启动跟踪。注意: 在跟踪过程中, 跟踪的单元格后面将放置鼠标指针并按下 “0” 键。细胞分裂, 细胞凋亡和丢失的细胞按钮可以监测这些特定的细胞事件。在跟踪实验时, 在跟踪实验时, 这些选项中的每一个都将自动显示在 “单元格编辑器” 窗口中绘制的沿袭树中。 一旦克隆被跟踪, 匹配明图片与 PICC 获得的免疫荧光图像, 以确定细胞的后代的性质。每个荧光通道都将在 “影片窗口” (通道1、2、等) 中表示。 5. 最后结果 一旦完成单单元格跟踪并识别后代, 请将实验 (单元格编辑器窗口/文件选项卡/保存当前树) 保存起来, 然后继续导出结果。 导出位于 “单元格编辑器” 窗口中的 “导出” 菜单中的沿袭树和单元格数据。同样, 通过 “电影窗口” 可访问的 “导出菜单” 导出单元格图像和电影。图像、沿袭树、数据和影片将被导出到 tTt 工作文件夹中。