Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos
Summary
Incompatibilidades em sequências de antigénios (HLA) leucocitário humano entre doador e beneficiários pares são a principal causa de rejeição mediada por anticorpo em transplante de órgãos. Aqui nós apresentamos o uso de matrizes de antígeno personalizado com base em sequências HLA dos doadores individuais para sondar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos.
Abstract
No transplante de órgãos, a função e a longevidade da prótese criticamente dependem do sucesso de controlar a reatividade de rejeição imunológica contra antígenos de leucócitos humanos (HLA). Diretrizes de histocompatibilidade são baseadas em testes laboratoriais de imunidade anti-HLA, que apresenta como pré-existentes ou de novo gerados anticorpos HLA que constituem uma barreira grande transplante. Testes atuais estão construídos sobre uma plataforma de grânulos single-antigénio (SAB) usando um conjunto fixo de ~ 100 pré-selecionados antígenos HLA para transplante soros de sonda. No entanto, em humanos, existem uma variedade muito maior de tipos HLA, com nenhum dois indivíduos que não sejam gêmeos idênticos que podem compartilhar a mesma combinação de sequências HLA. Enquanto tecnologias avançadas para a tipagem de HLA e sequenciamento direto precisamente podem capturar qualquer inadequações na sequência de DNA entre um doador e HLA do receptor, o ensaio de ORS, devido à sua variedade limitada em representação de sequência, é incapaz de detectar precisamente aloanticorpos especificamente contra o doador HLA mismatches. Procuramos desenvolver um método complementar, usando uma tecnologia diferente para detectar e caracterizar os anticorpos HLA de antiem doadores uma base personalizada. A ferramenta de seleção é uma matriz de peptídeo personalizado doador HLA-derivado de sequências de para sondar pós-transplante soros do destinatário órgão para avaliar o risco de rejeição mediada por anticorpo. Em um único array para um par de doador-beneficiário, até 600 exclusivos peptídeos são feitas com base em sequências de proteínas HLA do doador, cada peptídeo carregando pelo menos um resíduo incompatível em uma sequência de ácido amino-15. Em nossos experimentos piloto para comparar padrões de antígeno do pré e pós transplante sera nesses conjuntos, fomos capazes de detectar sinais de anti-HLA com a resolução que também nos permitiu identificar os epítopos imunes envolvidos. Estas personalizado matrizes de antígeno permitam a detecção de alta resolução de epitopos HLA do doador específico em transplante de órgãos.
Introduction
Terapia de substituição de órgão que é rotineiramente realizada em todo o mundo já salvou milhões de vidas. Transplantação de órgãos sólidos ocorre em cerca de 100 pacientes por milhão de pessoas nos Estados Unidos anualmente, ao passo que um número maior ainda colocorá receber órgãos de doadores devido a uma grave escassez de abastecimento (de acordo com informações fornecidas pelo órgão Colheita e transplante de rede – OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Transplante de órgãos é altamente regulada a fim de reduzir o desperdício de órgãos e salvar vidas, mas as ferramentas científicas usadas para informar a estes regulamentos são limitadas na eficácia. Por exemplo, a comunidade científica reconhece plenamente os Estados altamente polimórficos de moléculas HLA e precisos testes genéticos de DNA usando digitação de alta resolução e baseados em sequência de digitação (SBT) foram desenvolvidos nos últimos anos1, 2. no entanto, os métodos de ensaio Alo-anticorpo ainda não foram capazes de produzir a grande variedade de sequências individuais de HLA como sondas de antígeno. O teste padrão hoje em dia usa um painel invariável de ~ 100 antígenos alélicas que são compreendidos de variantes comuns de HLA, A, B, C, DQ, DP e DR sequências em populações humanas3,4,5,6. Frequentemente, sequências HLA do doador real não estão incluídas no painel de teste, forçando o transplante de médicos e cirurgiões para inferir a reatividade de doadores específicos com base em semelhanças compartilhadas entre sequências reais do doador e padrões”correspondentes” na teste conjunto7,8. Consequentemente, às vezes é difícil fazer uma estimativa confiável do risco de rejeição baseada em anticorpos teste resultados9,10,11,12. Portanto, Nova pessoalmente testes personalizáveis para aloanticorpos são urgentemente necessários13,14.
Os genes HLA codificam os receptores de (MHC) complexos principal de histocompatibilidade que têm uma função fundamental em respostas imunes6. Os genes HLA são conhecidos por serem os mais polimórficos genes do genoma humano6. Devido aos avanços rápidos no DNA sequenciamento estratégias para os genes HLA, novas variantes alélicas (ou simplesmente referido como alelos) estão sendo descobertas a uma taxa explosiva15,16. Em março de 2017, 16.755 alelos validados tiveram sido depositados no banco de dados IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), dos quais 12.351 de classe se eu fosse e 4.404 eram de grupos de classe II. Em contraste, apenas um pouco mais de 100 diferentes alelos são representados no ensaio padrão único-antígeno grânulos (SAB), que é usado rotineiramente para detectar aloanticorpos em transplante de órgãos. O método SAB é construído sobre uma plataforma de Luminex usando citometria de fluxo. Desde que o ensaio utiliza um conjunto invariável de antígenos, além de menores variabilidades de lote para lote em produção, o teste de soro pode ser robustamente padronizado entre indivíduos e entre laboratórios5. Entretanto, este teste é capaz de capturar todos os aloanticorpos desenvolvidos especificamente contra os alelos do doador, particularmente quando as sequências de doadores estão ausentes do SAB definido. Embora a produção personalizada de antígenos dos doadores, com base em sequências de verdadeiras são desejáveis, persistem os desafios técnicos em racionalizar a produção necessária e procedimentos de teste.
Recentemente descrevemos uma metodologia alternativa em um estudo de viabilidade do transplante renal assuntos17. O método usado antígenos de peptídeo em um formato de matriz pela investigação pré- e pós-transplante de soros de sujeitos individuais. Cada matriz personalizado foi construído usando o lugar síntese método18,19,20,21,22,23 que produz antígenos peptídeos, cada 15 aminoácidos de comprimento, inteiramente baseada em alelos HLA do doador do respectivo órgão de A, B, C, DQA1, DQB1 e DRB1. Síntese SPOT é operado em uma membrana de celulose usando padrão Fmoc-química22 e pode produzir centenas de peptídeos personalizados em paralelo com um sistema totalmente automatizado de robótica19,21. A matriz de membrana pode suportar várias rodadas de descascamento e ciclos de reprobing. Em nosso estudo retrospectivo17, detectamos mudanças nos padrões do antígeno com anti-soros transplante armazenados, coletados em uma série de tempo (ou seja, antes e após o transplante). Neste documento descrevemos o protocolo técnico para o fluxo de trabalho, incluindo o projeto da matriz, fabricação, análise de sondagem e resultado de anti-soro. O método destina-se para a detecção de aloanticorpos contra epítopos lineares específicos em moléculas HLA dos doadores de transplante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O desenho da matriz de ponto descrito aqui é para o estudo experimental de especificidade de Alo-anticorpo em transplante contra antígenos HLA do doador de órgãos. Em contraste com o ensaio SAB existente, amplamente utilizado na clínica, o método de matriz de antígeno tem uma grande vantagem em seu design flexível que pode acomodar as verdadeiras sequências HLA do doador individual. A nova plataforma explora os potenciais da tecnologia de sequenciamento de DNA rapidamente avançando que em breve será capaz de p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos os Drs Shawn Li e Li Xing de Western University, no Canadá por sua gentil assistência com mancha matriz de produção. Somos gratos aos membros do pessoal no núcleo histocompatibilidade e abrangente de transplante centro do noroeste da Universidade para a prestação de serviços de exemplo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo auxiliar placa de Northwestern Memorial Hospital e por um fundo de inicialização faculdade fornecido pela Northwestern University a JJ.
Materials
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| Non-fat milk | Bio Rad Laboratories | 1706404 | |
| TBST | Santa Cruz Biotechnology | 10711454001 | |
| Goat anti-human IgG–HRP | ThermoFisher Scientific | A18811 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad Laboratories | 1705061 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientifics | 21059 | |
| ChemiDoc gel imaging system | Bio Rad Laboratories | 1708265 |
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