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Neurociencias

Résection partielle du nerf optique chez le rat : un modèle mis en place avec une nouvelle approche du dispositif d’évaluation secondaire dégénérescence des cellules ganglionnaires rétiniennes

Published: October 15, 2017
doi:
10.3791/56272
, , , , , , ,
1Aier School of Ophthalmology,Central South University, Changsha, China, 2Institute of Immunology,Tsinghua University School of Medicine, Beijing, China, 3Beijing Tongren Eye Center,Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University; Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, Beijing, China, 4Beijing Institute of Ophthalmology,Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University; Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, Beijing, China

Summary

La dégénérescence des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) secondaire survient généralement dans le glaucome. Cette étude décrit une approche innovante du dispositif pour la résection partielle du nerf optique. L’utilisation de cette approche du dispositif encombrant étend le champ d’application du modèle et permet l’exploration des mécanismes de la lésion secondaire au CGR d’une manière nouvelle.

Abstract

Des études antérieures ont montré que la dégénérescence secondaire des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) est fréquente dans le glaucome. Résection partielle du nerf optique est considéré comme un modèle utile et reproductible. Par rapport aux autres modèles de lésion du nerf optique couramment utilisés pour évaluer la dégénérescence secondaire, par exemple complet nerf optique transection et nerf optique crush modèles, le modèle de résection partielle du nerf optique est supérieur car il distingue les primaires de dégénérescence secondaire sur Place. Par conséquent, il sert un excellent outil d’évaluation de dégénérescence secondaire. Cette étude décrit une nouvelle approche du dispositif de résection partielle du nerf optique en accédant directement à la zone du nerf optique rétrooculaire à travers la paroi latérale orbitale du globe oculaire. Par ailleurs, nous présentons un instrument chirurgical nouvellement conçu, à faible coût pour aider avec transection. Comme en témoignent les résultats représentatifs à distinguer la limite des zones de lésions primaires et secondaires, l’instrument et la nouvelle approche assure un rendement élevé et la stabilité du modèle en fournissant suffisamment d’espace pour une opération chirurgicale. Cela rend à son tour aisé de séparer la gaine méningée et navires ophtalmiques du nerf optique avant transection. Un autre avantage est que cette approche du dispositif encombrant améliore la capacité des enquêteurs pour administrer des médicaments, des transporteurs ou traceurs RGC sélectives sur le moignon du nerf optique partiellement sectionnée, permettant l’exploration des mécanismes à l’origine lésion secondaire au CGR, d’une manière nouvelle.

Introduction

Dégénérescence secondaire survient généralement dans le système nerveux central (CNS) après les traumatismes et les maladies neurodégénératives aiguës et chroniques suivantes. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 la mort des neurones et des cellules gliales comme conséquence au début des manifestations pathologiques primaires est appelée dégénérescence primaire, tandis que la dégénérescence secondaire se réfère à la mort des neurones et des cellules gliales, qui ne sont pas ou seulement partiellement affectés par primary dommages. Dégénérescence secondaire du CGR est également soupçonnée de se produire dans le glaucome. 6 Yoles et al. 7 a confirmé que la lésion secondaire du CGR s’effectue dans le modèle de lésion du nerf optique. Ils ont montré que les neurones dont les axones ont subi aucune blessure après qu’une lésion aiguë sera éventuellement dégénérer en raison de l’environnement dégénérative par la blessure qui entourent ces axones. Cette dégénérescence secondaire affecte les neurones de façon progressive liée à la gravité des dégâts infligés. Jusqu’à présent, les mécanismes qui sous-tendent les dommages RGC en glaucome demeurent incertains, notamment celles liées à la lésion secondaire, ce qui entraîne un traitement clinique insuffisant. 8 , 9 , 10 c’est pourquoi, il est nécessaire d’étudier les mécanismes sous-jacents de la dégénérescence secondaire du CGR au cours du développement du glaucome. 11 mise en place de modèles animaux de lésion secondaire qui peut évaluer de façon quantitative la taille, la distribution et le mécanisme de la dégénérescence secondaire du CGR attire l’attention croissante des scientifiques qui étudient la lésion secondaire du CGR.

Pour clarifier cette question, un modèle PONT de rat a été créé par Lebeau-Verbin et al. 12 pour évaluer les lésions axonales provoquée par la dégénérescence et la mort du CGR. Ce modèle est censé constituer un bon outil pour explorer les mécanismes de dégénérescence secondaire et identification des agents neuroprotecteurs potentiels. L’instrument utilisé pour générer ce modèle de lésion secondaire est un couteau diamant avec une échelle à transect quantitativement par réglage de la profondeur de l’abscission via le bouton du cadran, afin de compléter une transection quantitative du nerf optique. Le chemin d’accès chirurgical s’approche de la conjonctive de globe oculaire vers le haut ou temporelle. Au cours du processus du dispositif, la rétine et le nerf optique peut être affectée par la force de la pince, qui à son tour peut provoquer des lésions primaires. Plus important encore, en raison de l’espace limité du nerf optique exposé, il est difficile de séparer la gaine méningée avant incision. Par conséquent, il est possible d’endommager les vaisseaux ophtalmiques pendant transection partielle du nerf optique, qui se traduit par une ischémie rétinienne et l’échec du modèle. En outre, le couteau de diamant est coûteux, et chaque utilisation diminue la netteté de pointe. Cela pourrait à son tour affecter la profondeur et l’effet de modélisation.

Le modèle de la dégénérescence secondaire du CGR décrites dans la présente étude a été obtenu grâce à une nouvelle approche du dispositif de la paroi latérale orbitale du globe oculaire. Cette nouvelle approche du dispositif accède directement le nerf optique rétrooculaire encerclé par le cône de muscle orbital, évitant la lésion primaire à le œil et le nerf optique lorsque vous tirez vers le bas ou vers le côté nasal latéral du globe oculaire. Aussi, cela augmente l’espace d’une opération chirurgicale au cours de la création du modèle et active l’isolation de gaine méningée avant partiellement sectionner le nerf optique. Il est important de noter que la participation involontaire et les lésions des vaisseaux ophtalmique peuvent conduire à l’échec du modèle. En outre, le modèle permet un suivi de l’évaluation des cellules transfectées, médicaments et réactifs sur le moignon du nerf optique partiellement sectionnée. L’individu-conçue instrument chirurgical est bon marché et peut être utilisé plusieurs fois, ce qui réduit le coût de la modélisation. Le modèle de lésion secondaire du CGR créé par cette méthode a démontré que la stabilité et la bonne reproductibilité.

Protocol

procédures avec des sujets animaux ont été approuvées par l’animal institutionnel soin et d’utilisation de Comité (IACUC) de l’Université de médecine de la capitale. Tous les instruments chirurgicaux et des solutions ont été stérilisées avant la chirurgie afin de limiter les infections microbiennes. Remarque : le protocole chirurgical comprend cinq parties, à savoir l’anesthésie, approche chirurgicale, évaluation du nerf optique, clôture et récupération. Pour faciliter une transection quantitative partielle du nerf optique, un nouvel instrument chirurgical faible coût a été conçu. Toutes les procédures ont été effectués suivant les règles d’éthique et de la technique chirurgicale. 1. Technique chirurgicale mener des expériences en utilisant la technique aseptique ; protocoles pour l’utilisation des animaux devraient être institution spécifique. Instruments de stériliser et matériaux (solutions, les substances d’essai, traceurs, aiguilles, etc.) venant en contact avec les tissus vivants afin de prévenir toute infection et effets néfastes sur le bien-être animal, ainsi que les impacts négatifs potentiels sur l’étude . 2. Anesthésie des rats d’anesthésier SD en utilisant un système de vaporisateur isoflurane vétérinaire. Utilisent de l’oxygène de qualité médicale à un débit de 1 L/min pour vaporiser le gaz isoflurane. Placer l’animal dans la zone d’anesthésie ci-joint et exécutez isoflurane à une concentration de 4,5 % jusqu’à ce que la respiration lente et sédation animale. Passer le débit de gaz à la fixation du masque à gaz et placez l’animal sur la table d’opération. Abaisser la concentration de l’isoflurane à 2 % et le moniteur de l’anesthésie. Grands animaux (> 300 g) peuvent nécessiter une concentration plus élevée de l’isoflurane. Anesthésie du moniteur pendant la chirurgie, avec l’isoflurane posologie ajustée en conséquence. Constamment évaluer la profondeur et le taux de respiration et effectuer orteil pincée évaluation toutes les 5 min, pour assurer l’absence de douleur profonde. Une fois la chirurgie terminée, éteignez l’isoflurane et laisser l’animal à l’oxygène de la respiration pendant plusieurs minutes avant du retirer de la table d’opération. Maintenir la température corporelle en couvrant l’animal avec une couverture chirurgicale et/ou en l’utilisant une couverture de chauffage pendant la chirurgie. 3. Individu-conçu Instrument Assistant chirurgical (SSAI) utilisation une SSAI faite d’acier inoxydable et surtout comprend un pôle à main (longueur, 100 mm ; diamètre, 9 mm) et une tête entaillée ( Figure 1). La surface rainurée de la tête entaillée est semi-circulaire, avec profondeur verticale, la largeur et longueur de 200 µm, 500 µm et 1 000 µm, respectivement. Entre les deux parties, il y a un tronçon commun avec une longueur de 50 mm. La tête entaillée ' s edge est large de 300 µm. Remarque : La surface rainurée permet la stabilisation du nerf optique ventral pour transection. Le nerf optique dorsal est exposé à l’extérieur de la rainure quand la face ventrale du nerf optique pond qu’il contient ; pendant ce temps, le nerf optique dorsal exposé au bord rainuré peut être recoupée lors de coupe verticale. Le nerf optique ventral, jeté dans la surface rainurée est protégé par la tête entaillée ' bord de s. Atteindre la lésion primaire dans les CGR correspondant aux axones quantitativement sectionnée nerf optique (face dorsale), tandis que le secondaire blessure serait effectuée dans les CGR correspondant aux axones untransected nerf optique (face ventrale) sans dommages directs. 4. Approche chirurgicale lieu le côté droit du rat en haut sur la table d’opération chirurgicale avec tête orientée vers le chirurgien. Ajuster l’orbite droite dans le centre du champ de vision chirurgicale. Ensuite, nettoyez l’incision plusieurs fois le long du canthus latéral pour le foramen acoustique externe de la peau orbitale droite, appliquant la chlorhexidine 0,5 % dans l’éthanol à 75 %. Enlever la fourrure entre le canthus latéral pour le foramen acoustique externe à l’aide de ciseaux iris. Faire une incision de la peau à l’aide de ciseaux iris le long le canthus latéral pour le foramen acoustique externe d’une longueur de 0,5 à 1 cm. Puis, pincer le fascia et tirer vers le haut pour créer un coin triangulaire avec une pince dentée 0,12 mm. Insérez la lame inférieure de ciseaux de Vannas printemps dans la zone de l’incision et fend le carénage dans le même sens de cisaillement. Coupe le carénage avec Vannas printemps ciseaux et expose la veine orbitale. Utilisation sharp-dentelé pinces pour fixer les côtés de la veine orbitale et émousser ouvrent les deux côtés de l’incision. Placez la veine orbitale en direction de la surface du muscle orbital, qui est bien placée pour faciliter l’opération de suivi chirurgicale et d’éviter une chirurgie associés saignement de la veine orbitale. Utiliser des ciseaux pour couper le droit canthus latérale le long de la ligne d’incision pour exposer entièrement le champ de vision pour la dissection non tranchante des muscles orbitaux pendant suivre jusqu’à iris Continuer à serrer le dossier du muscle orbital sous-urétral et émousser séparer verticalement dans le sens de l’incision de la peau et le fascia. Séparés le long des côtés progressivement pour atteindre la profondeur de l’orbitale, jusqu’à l’apparition du tissu adipeux orbitale. Après l’exposition du tissu adipeux orbitale, changer le sens de tête de rat de faisant face au chirurgien verticalement par rapport à la droite du chirurgien. Pendant ce temps, observer la zone constamment humides à l’aide chirurgicale ou des tampons de coton contenant du PBS stérile. Cette procédure assure une vision claire du champ chirurgical, tout en gardant les tissus humide et doux. 5. Accès au nerf optique coupe des tissus adipeux orbitales couvrant le cône de muscle orbital autour du nerf optique dans la cavité orbitale. Ceci assure une meilleure exposition de l’approche chirurgicale appropriée. Gardez résection du tissu gras limitée pour éviter subies saignement. Couper le tissu graisseux, exposant le rectus latéral. Fixez le rectus latéral vers l’extérieur et puis le couper avec des ciseaux de Vannas printemps. Si le tissu graisseux reste sous le rectus latéral, tirez sur la graisse recouvrant le nerf optique à l’aide de 0,12 mm dents de pinces et le couper avec des ciseaux de Vannas printemps. Remarque : Pour l’instant, la gaine de tissus autour du nerf optique doit être visible. Continuer à séparer la gaine de tissu le long de la direction du nerf optique dans la profondeur de l’orbitale, jusqu’à ce que l’exposition totale du nerf optique. Garder la zone propre à l’aide chirurgicales écouvillons pour nettoyer les petites quantités de sang qui découlent de la suppression des tissus. NOTE : Maintenant, le nerf optique doit être visible. Afin d’y accéder, enlever la gaine méningée qui entoure le nerf sans endommager l’artère ophtalmique. Tourner délicatement la gaine afin d’examiner le modèle vasculaire de la dure-mère à fort grossissement sous un microscope opératoire. Identifier une zone dépourvue de vaisseaux sanguins et d’effectuer une coupe longitudinale sur le dura. 13 rip la gaine parallèle à la direction du nerf optique avec une pointe d’aiguille 26G ou couteau de saphir sonde chirurgicale avec précaution, en évitant d’endommager le système vasculaire avec découpes latérales. Remarque : Les seuls restes couvrant le nerf doivent être l’arachnoïde membrane, qui est très fine et transparente. Similaire à l’étape 5.2, déchirer l’arachnoïde doucement avec une pointe d’aiguille 26G ou couteau de saphir sonde chirurgicale, parallèle à la direction du nerf optique. 13 lay le nerf optique dans la rainure de l’instrument doucement et avec précaution, résultant dans le nerf optique dorsal étant légèrement supérieure à celle du bord de tête rainuré. Pour l’instant, le nerf optique dorsal au-dessus du bord de la plate-forme de tête rainuré avec une pointe d’aiguille 26G ou couteau de saphir sonde chirurgicale pour compléter la résection partielle du nerf optique du transect. 6. Fermeture et de restauration direction déplacer l’instrument un peu plus loin vers la verticale du nerf optique pour libérer ce dernier. Puis, retirez la tête entaillée de l’instrument doucement. Essayez de ne pas rayer les muscles oculaires ou autres tissus pour éviter des dégâts supplémentaires. Le moignon de résection partielle du nerf optique peut être observé. Remplacer le rectus latéral, fascia et autres tissus environnants de le œil à leurs positions d’origine. Puis, suture du muscle et les couches de la peau de l’orbite en séquence. Si le saignement persiste, doucement remplir avec un tampon d’ouate médicale avant de refermer la plaie et maintenir ce pour une période de temps. Appliquez une pommade antibiotique sur la plaie pour prévenir l’infection. Tour de la source de l’isoflurane et laisser l’animal à l’oxygène de la respiration pendant plusieurs minutes. Dans le processus de réanimation de rat, préparer une isolation thermique avec un tapis chauffant, ou couvrir la surface de la cage avec un rembourrage sec. Les animaux avec des couvertures, pour assurer la perméabilité des voies aériennes de rat pendant le processus de récupération. Abriter les animaux individuellement après la chirurgie. Administrer les analgésiques postopératoires conformément aux directives fournies par les autorités institutionnelles de soins aux animaux. Surveillez attentivement les animaux après chirurgie.

Representative Results

Pour vérifier le succès concernant l’établissement d’un modèle de lésion secondaire avec la nouvelle approche du dispositif à l’aide de SSAI (Figure 2 a), CGR sont marqués marqués immédiatement après la création du modèle. Cette procédure visait à étiquette CGR marqués en injectant un colorant traceur neural (3 % fluorophore (p. ex., Fluorogold) dans une solution saline de tampon phosphate stérile) dans le colliculus supérieur (Figure 2 b). Cette approche conduit à étiquetage reproductible des CGR viables avec peu de variation. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 le colorant sera marqués repris par CGR dans la rétine et constitue un marqueur pour les CGR direct, avec les axones non recoupées dans le œil droit. Pendant ce temps, les CGR correspondant au nerf optique partiellement sectionnée axones dans l’oeil droit n’a pas peuvent être étiquetés avec colorant traceur (Figure 2). Comme un œil de contrôle, le œil gauche sans opération, CGR le long du nerf optique de la rétine sont tous marqués par l’or agent fluorescent de façon rétrograde du colliculus supérieur (Figure 2D). Sept jours après la résection partielle du nerf optique et marquage rétrograde du CGR, les rétines ont été récoltés, fixe, aplaties et montés. Les CGR marqués ont été photographié sous un microscope à fluorescence dans des régions définies de la rétine. Les résultats de fluorescence-étiquetée CGR avec ou sans résection partielle du nerf optique sont indiquées à la Figure 3. Seul les CGR dans la rétine droite correspondant à la partie untransected du nerf optique ont été marquées avec or fluorescent, et une limite claire du CGR non marquées et étiquetées pourrait être visualisées (Figure 3 a, Figure 3 b), démontrant la transaction partielle du nerf optique. Comme un œil de contrôle, tous les CGR de la fluorescence de rétine a montré œil gauche (Figure 3, Figure 3D). Pour évaluer si la vascularisation autour de la tête du nerf optique et l’artère ophtalmique qui fournit le sang à l’entoretina ont été blessés et touchés pendant l’opération, le fond de le œil droit a été photographié avant et après la chirurgie. Les images ont montré des réserves de sang à l’oeil droit (oeil du dispositif) avant et 1 heure après l’opération. Sang dans les artères était adéquate. Aucune obstruction de la veine a été observée. Ces résultats indiquent qu’il n’y avait aucun dommage pour le système d’approvisionnement en sang au cours de l’opération (Figure 4 a, Fig. 4 b). Par conséquent, le modèle de dégénérescence secondaire du CGR a été établi. Figure 1 : Photographies de l’instrument de l’individu-conçues assistant chirurgical, SSAI. (A) une vue panoramique sur l’instrument chirurgical, avec deux parties principales, y compris un poteau à main et une tête entaillée. Entre eux, il y a un tronçon commun avec une longueur de 50 mm. La longueur du poteau à main est de 100 mm et le diamètre du poteau à main est 9 mm. (B) une caractéristique de la rainure SSAI. La surface rainurée de la tête entaillée est semi-circulaire, qui permet le nerf optique d’établir qu’il contient, est stabilisée pour transection. La surface rainurée est d’une profondeur verticale de 200 µm et une largeur de 500 µm et une longueur de 1 000 µm. La largeur du bord de la tête entaillée est 300 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Diagramme schématique du CJR marquage sur la rétine après résection partielle du nerf optique droite avec l’instrument de l’individu-conçues Assistante chirurgicale (SSAI) et étiquetage marqués le colliculus supérieur avec le fluorophore. (A) l’avis chirurgical de résection partielle du nerf optique droite chez les rats avec l’instrument de l’individu-conçues Assistante chirurgicale (SSAI). (B) après la modélisation, les CGR sont marquées marqués en injectant un colorant traceur neural (couleur jaune, 3 % fluorophore en solution saline tampon phosphate stérile) dans le colliculus supérieur dans le cerveau. Étant donné que les axones des CGR résident dans le colliculus supérieur, le colorant traceur est repris par les CGR marqués et constitue un marqueur des cellules vivantes. La section transversale de la figure représente une coupe transversale du nerf optique. OD, œil opéré ; OS, oeil de contrôle sans opération. (C), seulement les CGR correspondant à la partie untransected du nerf optique ont été marquées avec un fluorophore. Bleu représente attenants ventrales nerfs d’optiques et les CGR correspondantes sur la rétine ; rouge reflète partiellement sectionnées dorsales optique nerfs et les CGR correspondantes sur la rétine. (D) la rétine de le œil gauche (oeil de contrôle) sans l’intervention chirurgicale, les CGR étaient tous étiquetés par le colorant. Dorsaux et ventraux des nerfs optiques sont tous étiquetés par le colorant ainsi. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Micrographies épifluorescence rétine entière du fluorophore étiqueté CGR 7 jours après avoir établi la résection partielle du nerf optique modèle et rétrograde de l’étiquetage du colliculus supérieur. Les schémas correspondants des Fluorogold teinté zones RGC sur la rétine sont également présentées. (A) et (C) représentent les schémas des CGR dans la rétine du droit (operative) et les yeux de la gauche (contrôle) après marquage avec un fluorophore, respectivement. Jaune indique la zone étiquetée avec le colorant fluorescent or. La rétine est divisée en parties dorsales, ventrales et centrales. (B) et (D) représentent ensemble rétinienne épifluorescence micrographies obtenues sous un microscope à fluorescence ; jaune représente la zone de CGR marquées avec un fluorophore. Dans la chirurgie ophtalmologique (œil droit) indiqué sur la B, la région sans étiquette représente la zone de CGR correspondant au nerf optique qui est partiellement recoupée, principalement sur la face dorsale de la rétine. La région étiquetée par le colorant fluorescent or est la zone de CGR correspondant au nerf optique qui n’est pas traversé et surtout concentré dans les faces ventrales et centrales de la rétine. Le bounDary entre les zones de non marquées et étiquetées CGR est clair. Dégénérescence primaire des organes de la CJR serait limitée à la rétine dorsale, et toute perte d’organes RGC dans la rétine centrale et ventrale peut être attribuée à la dégénérescence secondaire. (D) toute rétinienne Photomicrographie de le œil gauche après marquage des CGR avec un fluorophore. Les CGR de le œil gauche contrôle sans intervention chirurgicale ont été totalement souillé par un fluorophore. Barreaux de l’échelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Images préopératoires et postopératoires de le œil de le œil droit obtient par caméra Fundus. (A) , l’Image du fond de le œil avant la chirurgie de le œil droit chez le rat, bonne circulation sanguine de le œil, remplissage artériel et aucun retour veineux ou d’obstruction, ce qui indique un système d’approvisionnement sanguin rétinien bon. (B) l’Image de le œil de le œil droit 1 heure après la chirurgie. Aucun changement significatif par rapport à l’image préopératoire du fond de le œil, ont été observées dans l’approvisionnement sanguin rétinien, indiquant que le système d’approvisionnement en sang du globe oculaire n’est pas affecté au cours du processus de modélisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Photographies de rétrooculaire nerf optique et l’artère ophtalmique situé sur la gaine méningée, capturée par le biais de l’approche chirurgicale. Après avoir complètement supprimé la longueur ciblée du nerf optique, l’artère ophtalmique (pointe de flèche) concomitante avec la gaine méningée du nerf optique a été exposée et parallèle au nerf optique. Barreaux de l’échelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Diagramme schématique des emplacements primaires et secondaires de la dégénérescence du nerf optique. Incision partielle du nerf optique a été réalisée à l’aide de l’instrument de l’individu-conçues Assistante chirurgicale (pointe de flèche). Les axones en sites directement endommagés (site de coupe dorsale du nerf optique dans la section transversale en gris) subissent une dégénérescence primaire, tandis que celles de sites indirectement endommagées (zones centrales et ventrales du nerf optique dans la section transversale en jaune) subissent une dégénérescence secondaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Procédure opérationnelle

Il y a quelques points dignes d’avis dans le processus de construction de modèle. À l’étape 4.2, le mouvement chirurgical doit être effectué avec précaution pour éviter d’endommager le système vasculaire au-dessus du muscle sous-fascial. En particulier, lorsque vous coupez le fascia sous-cutané dans le canthus latéral externe, pinces dentelées de sharp devrait servir à tirer vers le haut le fascia sous-cutané sur l’aire de carénage verticalement ; le fascia doit être coupé avec Vannas printemps ciseaux pour ne pas endommager la veine orbitale au canthus externe, qui peut causer la défaillance du modèle par un saignement excessif. Étape 4.3 a l’avantage de potentiellement prévenir les saignements lors de la suppression directement des vaisseaux sanguins. En séparant les muscles orbitaux en étape 4.5, le motif pour cueillette sharp-dentelé forceps mais pas de Vannas ciseaux de printemps est d’éviter les saignements continu et l’hémorragie. Les muscles sont carrément séparées des deux côtés dans la direction perpendiculaire à l’incision du fascia cutanée ; pendant ce temps, les muscles profonds de l’orbite sont tendus vers l’extérieur et en périphérie. Cette procédure va révéler les parties plus profondes de la cavité orbitale, fournissant une plus grande fenêtre chirurgicale et permettant un accès sans entrave aux tissus qui vient se superposer le nerf optique. Les procédures ci-dessus, si le saignement se produit, la pression devrait s’appliquer à l’aide de stérile chirurgicale ou cotons-tiges. Saignements mineurs seront arrête après quelques secondes de cette procédure. L’étape 4.6 vise à faciliter les opérations de suivi pour enlever facilement certains muscles gras et distinctes dans le cône de muscle orbite pour exposer le nerf optique dans la direction du nerf optique dans la profondeur de l’orbitale.

Les parties les plus critiques du protocole actuel vont 5.1 à 5.6. Il est important de ne pas endommager la vascularisation autour de la tête du nerf optique. Le nerf optique doit être partiellement traversé au moins 1,5 à 2,0 mm à l’arrière de le œil, pour éviter tout dommage à l’artère ophtalmique qui pénètre le nerf à 1 mm de l’oeil et fournit le sang à la rétine interne. Le but de couper le rectus latéral est d’atteindre la meilleure exposition du nerf optique que le rectus latéral est large et évidemment bloque la vue du nerf optique. En attendant, pour éviter de supprimer de l’artère ophtalmique qui est associé avec la gaine méningée (Figure 5), il est nécessaire de séparer et de dissocier la dure-mère autour du nerf optique et d’examiner le modèle vasculaire de la gaine méningée, à l’aide de pinces à tourner délicatement la gaine. En outre, une zone dépourvue de vaisseaux sanguins doit être identifiée, ce qui permet une découpe longitudinale dans la gaine méningée. Il est également nécessaire de maintenir une petite distance de travail de l’arrière de le œil, pour éviter le passage de la dure-mère qui est étroitement lié à l’artère ophtalmique. La rétine est normalement transparente, et les vaisseaux sanguins peuvent être clairement délimitées. Dans le cas de l’approvisionnement sanguin rétinien endommagés, la rétine est dégénérée, conduisant à un aspect floconneux blanc laiteux. La cavité vitréenne de l’oeil et la lentille deviendra généralement nuageuse ainsi, avec la taille de le œil une baisse au fil du temps. Dans cette étude, les images préopératoires et postopératoires du fond de le œil a confirmé aucun dommage à l’approvisionnement en sang du fond de œil dans le modèle après avoir appliqué les étapes ci-dessus.

En outre, une attention particulière est requise en plusieurs étapes de ce modèle. Lors de l’utilisation de forceps sharp-courbé-dentelé ou autres instruments chirurgicaux pour exposer le nerf optique, le chirurgien devrait éviter une force excessive, car cela pourrait endommager le nerf optique, la globe oculaire ou l’artère ophtalmique, ce qui entraîne des lésions primaires, ischémie rétinienne. En outre, les vaisseaux sanguins entourant l’oeil ne si pas est endommagés, pour éviter tout saignement soutenue, qui pourrait conduire à l’échec de la modélisation. La SSAI utilisée dans cette expérience requiert l’utilisation délicate. Lorsque le nerf optique est placé dans la rainure de l’instrument, le nerf optique et la surface rainurée doivent être insérée afin d’assurer la bonne consistance et la répétabilité de chaque modèle animal. Avec la pratique, l’intervention chirurgicale complète peut être complétée en 15-20 minutes par oeil, après ont effectué les découpes de l’entrée initiale.

Wang et al. 19 a publié un modèle animal similaire de résection partielle du nerf optique établie à l’aide d’un amputator quantitative du nerf optique. Les interventions chirurgicales comprend : 1) découpe apart le canthus externe, suspension et fixation palpébral supérieur ; 2) explorant le nerf optique et ensuite la partie supérieure du nerf optique à l’aide de l’amputator ; et 3) suture la conjonctive et la peau. Bien que l’intervention chirurgicale était relativement simple, les problèmes suivants ont été rencontrées pendant l’opération. Bien que l’incision latérale canthus pourrait exposer certain espace pour l’opération, il y avait un besoin inévitable de constamment s’étirer le globe oculaire afin d’exposer la gaine du nerf optique rétrooculaire, surtout quand les chirurgiens souhaitent exposer une plus longue rétrooculaire gaine de nerf optique afin de faciliter davantage la gaine d’isolation ; la force d’étirement du globe oculaire était plus grande, qui est susceptible de causer un dommage de traction directe du globe oculaire et nerf optique. Aucune attention particulière n’a été versée à des vaisseaux sanguins qui peut être coupés avec la gaine du nerf optique, et les dommages aux vaisseaux sanguins sont susceptibles de conduire à la création de modèle a échoué. Les principales procédures de lésion secondaire modèle décrit dans cet article sont : une coopérative de nouvelle approche de la paroi latérale orbitale du globe oculaire pour accéder directement au nerf optique rétrooculaire entouré par le cône de muscle orbital, évitant la lésion primaire à la globe oculaire et nerf optique, en tirant vers le bas ou vers le côté nasal latéral du globe oculaire. Cette nouvelle approche du dispositif augmente l’espace d’une opération chirurgicale au cours de modélisation et permet facilement d’isolation de la gaine méningée, qui est étroitement liée à l’artère ophtalmique, avant la résection partielle du nerf optique. Résection partielle du nerf optique a été réalisée avec un instrument chirurgical individu-conçu, ce qui est rentable et réutilisables, en réduisant le coût global de la modélisation. Structure orbitale de rat est différente de celle des autres mammifères, avec l’orbite le plus proche le canthus et aucune structure osseuse, mais couvert de muscles. L’approche chirurgicale pourrait atteindre la partie postérieure du globe oculaire sans avoir besoin de détruire l’OS orbital et le périoste. Grâce à la stricte désinfection préopératoire et postopératoire prophylaxie antibiotique, infection, une inflammation et un oedème ont été considérablement réduits.

Individu-conçue Instrument Assistant chirurgical

Le modèle de rat de résection partielle du nerf optique a été créé à l’aide de l’instrument de l’individu-conçues assistant chirurgical, dont les principales caractéristiques sont les suivantes. Elle peut aider à une transection quantitative partielle du nerf optique exposé au bord rainuré, également transection uniformité entre les différents animaux. Nous avons testé et vérifié la répétabilité de création de modèle avec SSAI. Le coefficient de variation maximal était de 1,85 %, avec une valeur moyenne 0,67 % ±0. 44 %. 20 ces résultats indiquent que le SSAI pourrait servir à établir des modèles de résection partielle du nerf optique, reproductibilité satisfaisante et des Nations Uniesiformity.

Largeur de la surface rainurée et la conception de l’hémicycle de la surface intérieure de la rainure peuvent avoir un effet plus fixe sur le nerf optique et rendre la surface rainurée et nerf optique attacher plus étroitement, diminuant également les erreurs expérimentales et effets indésirables. Le bord rainuré permet une meilleure protection du nerf optique dans la gorge au cours de l’opération, qui n’endommagera pas le nerf optique dans la rainure, quelle que soit la netteté de la fraise. Un autre avantage du bord rainuré est écraser la prévention des blessures au cours de la résection du nerf optique.

Il convient pour le fonctionnement dans l’espace profond et étroit. Bien que la nouvelle approche du dispositif a été élargie, la voie reste profonde, et le pôle à main et l’articulation peuvent être utilisés pour placer la tête entaillée facilement sous la gaine du nerf optique pour effectuer des opérations de suivi. Lorsque l’instrument est utilisé pour l’opération, un large éventail d’outils de coupe peut être utilisé pour transection, par exemple une pointe d’aiguille 26 G. Même un couteau saphir sonde chirurgicale peut être sélectionné pour éviter une contusion et écraser les blessures causées par des ciseaux. Rainure surfaces sont possibles dans différentes profondeurs verticales pour compléter des degrés de la Coupe du nerf optique.

Par rapport à l’amputator de Wang et coll. le SSAI a une structure plus simple. En outre, l’étape de la coupe est plus pratique à l’aide de la SSAI, avec cohérence améliorée et une répétabilité du modèle animal. Enfin, la gamme des outils applicables pour la coupe avec la SSAI est également plus large. En conclusion, SSAI, ce qui en fait des incisions quantitatives et uniformes du nerf, peut être un instrument efficace pour établir des modèles de rat pour évaluer la résection du nerf optique.

Caractéristiques du modèle résection partielle du nerf optique chez Rat

Le modèle de résection partielle du nerf optique est utile pour évaluer la dégénérescence secondaire au CGR. Le potentiel mérite de ce modèle est la capacité de séparer primaire de dégénérescence secondaire avec précision sur place, aussi bien dans le nerf optique et la rétine. Les nerfs optiques centrales et ventrales étaient plus vulnérables à une lésion secondaire après résection partielle (environ 1/3 à 1/2) du nerf optique dorsal (Figure 6). Dans la rétine, la localisation régionale des lésions primaires et secondaires du CGR devrait reposer sur la topographie de nerf optique correspondant à la rétiniens CGR après résection partielle. Si la rétine entière du rat est divisée en dorsale (supérieur) et ventrales (inférieures) pièces, lésions primaires et secondaires sont présentes dans les deux parties. Cependant, basée sur la relation entre les CGR sur la rétine et le nerf optique axon, mort RGC dans la rétine ventrale devrait être principalement attribuée à une lésion secondaire (Figure 3). 12 , 22 , 23 les avantages de ce modèle : instrument simple et facile à utiliser avec des procédures standards ; aucun effet sur les vaisseaux ophtalmique ; bonne reproductibilité et la stabilité. Cette technique pourrait servir à transfecter les CGR de cette approche du dispositif encombrant en appliquant quelques ARN interférents (siARN), plasmides, et souche de vecteurs viraux pour le nerf optique partiel ; en outre, les réactifs pourraient être placés sur le moignon partielle du nerf optique pour le traitement sélectif ou étiquetage des CGR.

Globales, primaires et secondaires des blessures du CGR coexistent après résection partielle du nerf optique dans ce modèle animal, avec une limite claire dans la rétine entre les types de deux blessures. Bien que l’association des axones du nerf optique et l’emplacement de la GRC sur la rétine nécessite une enquête plus approfondie pour une distinction plus précise, cette approche du dispositif encombrant s’étend le champ d’application du modèle et permet aux chercheurs d’étudier la mécanismes de lésion secondaire au CGR d’une manière nouvelle.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles de Pékin (7152038), le Fonds de recherche fondamentale pour les universités de la centrale de l’Université de South Central (2016zzts162) et le Science Research Foundation d’argouarch oeil hôpital groupe (Grant No. AF156D11). Enfin, Fancheng Yan Merci Xu Yiping pour le soutien inestimable au fil des ans.

Materials

Animal Aneathesia Ventilator System MIDMARK Matrx VMR
Isoflurane RWD Life Science Co. R510-22
Surgical Microscope Leica AG, Heerbrugg, Switzerland M620 F20
Tobramycin Eye ointment Alcon H20110312
Fluorogold Biotium 80014
Iris scissors 66vision Co. 54026
Vannas spring scissor 66vision Co. 54137B
Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps  66vision Co. 53329A
Sharp-curved forceps 66vision Co. 53324A
Sapphire surgical probe 66vision Co. 50205TA
26G needle tip Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. 3151474
10 μl Hamilton Syringe Hamilton Co. 80030
5-0 non-absorbable suture Johnson & Johnson International Co. W580
Chlorhexidine Sigma-Aldrich 282227
Stereotaxie apparatus RWD Life Science Co. 68026
Retinal Imaging System OptoProbe Ltd. OPTO-RIS
RetCamII wide field imaging system Clarity Medical Systems,Inc. RetCamII
Fluorescence microscope Leica Microsystems Inc. DM6000
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Referencias

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Yan, F., Guo, S., Chai, Y., Zhang, L., Liu, K., Lu, Q., Wang, N., Li, S. Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (128), e56272, doi:10.3791/56272 (2017).
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