단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

1. 세포 배양 및 안정 된 세포의 생성 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 하는 최소한의 필수 매체에 성장 조-K1 셀. 5% CO 2 37 습도 인큐베이터에서 셀 유지 ° c. C 터미널으로 인간의 XRCC1를 포함 하는 플라스 미드 DNA의 1 µ g 조-K1 transfect 세포 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 제조 업체에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 ' s 지침. 선택 조-K1 XRCC1 GFP 표현 인구를 이용한 형광 세포 분류 (FACS)를 사용 하 여 풍부 하 게 안정적으로 800 µ g/mL geneticin를 사용 하 여 인간의 XRCC1 GFP 융합을 표현 하는 셀. 그래서 그들은 약 75% 또는 더 큰 confluency에 도달 다음 날 coverglass 바닥으로 문화 선박에 마이크로 반구 되도록 플레이트 세포. 셀 사이의 공백은 바람직한 돌아가려면 동일한 이미지 필드 (설명된 섹션 3.2) 등록을 사용 하는 경우에 특히 일부. 2. 현미경 설정 마이크로-방사선/photostimulation에 대 한 적합 한 레이저 및 광학, 및 제어 소프트웨어를 갖춘 레이저 스캔 선택 confocal 현미경. 355 nm 레이저, 검 류 계 photoactivation miniscanner에 섬유 결합을 포함 하도록 수정 된 confocal 현미경 스캐닝 레이저 실험 사용을 제시 하 고 제조 업체를 사용 하 여 제어 ' s 제어 및 분석 소프트웨어. 이 시스템은 마이크로-방사선 조사 (ROI)의 사용자 지정 영역에서 photoactivation miniscanner (355 nm 레이저) 또는 표준 confocal 검 류 계 (405 nm 레이저)를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마이크로-방사선, 마이크로 조사 광에 모든 광학 구성 요소는 선택한 파장에 적합 확인에 사용할 파장 선택. 참고: 제시 시스템 사용 355 nm 마이크로-방사선, 자외선 필터 큐브 함께 40 × C-Apochromat (수 가늠 구멍 (NA) 1.2) 기름 침수 목표 및 표준 공초점 레이저 광을 사용 하 여 20 × C-Apochromat (NA 0.75) 건조 목적 대 한 방사선-405 nm 마이크로. 설치에 사용 되는 20 × 목표 355 nm 파장;와 호환 되지 않습니다. 따라서 우리 용 40 × 355 nm만. 면역 형광 검사 프로토콜 하류 침수 기름 떨어져 청소 없이 적용 될 수 있습니다 손상 건조 목표를 사용 하 여,이 때문에 우리가이 목표를 가능 하면 사용. 는 마이크로 방사선 실험에 대 한 현미경을 구성합니다. 실험 간의 일관성을 유지 하려면 각 유형의 마이크로 조사에 사용할 현미경 부품의 표준화 된 구성을 지정 합니다. 이러한 설정을 현미경 내 프리셋으로 저장 ' 운영 소프트웨어, 가능 하면 s. 참고: 제시 시스템에서 셀 마이크로 반구 있으며 단방향 검색, 검색 줌, 1 1024 x 1024 픽셀의 스캔 해상도 사용 하 여 몇 군데 8 프레임 (초당 프레임), 그리고 pinhole의 프레임 속도로 설정 약 4 공기 단위 (AU)로 488 nm 레이저 (69 µ m)에 대 한 결정. 이 오픈 pinhole 설정을 낮은 레이저 파워를 이미징 및 photobleaching 감소 사용할 수 있도록 각 이미지에 캡처된 빛의 양을 최대화 하기 위해 선정 되었다. 3. 레이저 마이크로 조사 장소는 준비 문화 접시, 현미경 스테이지 및 장소에 안전 하 게 잠금에 관심사의 세포를 포함 하. 가능 하다 면, 무대 상단 인큐베이터에서 연 발된 슬라이드 놓고 손상 유도 중 5% CO 2와 37 ° C에서 유지 합니다. 이 단계는 라이브 셀 timelapse 이미징 또는 긴 세션 이미징에 대 한 가장 중요 한. 그렇지 않으면 장소 세포는 현미경에 무대와 실내 온도에 조사 수행 (~ 25 ˚C), 다음 신속 하 게 돌아가려면 셀 5% CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터. 연구원 고정, 얼룩, 또는 다른 절차를 수행한 후 같은 위치로 돌아갈 수 있도록 이미지 필드를 등록. 인코딩된, 자동화 된 현미경 단계를 사용 하 여 손상 된 필드의 등록을 수행 하거나 XY 위치의 에칭 또는 레이블이 눈금 문화 coverglass 혈관 세포. 문화 선박 (즉, coverglass 또는 우물 사이 방 벽의 모서리)의 인식할 수 있는 기능을 선택 하는 이미지를 수집 하 고 XY 위치를 기록 소프트웨어 이미지 등록을 사용 하 여 . 이 정렬 및 선택한 필드를 다음 샘플 준비의 XY 위치 등록에 대 한 허용 됩니다. 수동 등록을 사용 하는 경우 기록 그리드 또는 각 필드에 대 한 에칭된 위치 수동으로, 스테이지의 방향 및 접시의 배치를 기록 주의. 셀 문화 선박에 대 한 식별 기능이 없는 사용할 수 있다면 세포 형태 및 밀도의 검사에 의해 손상 된 필드를 식별 합니다. 충분히 고유한 기능 나중 이미징 동안 인식할 수 있는 필드를 선택 하. 참고:이 방향 및 지역 문화 선박의 밀접 하 게 제한 하지 않는 한 수행에 시간이 걸릴 수 있습니다. 마이크로 조사에 대 한 필드를 선택 하 고 샘플을 집중. 붙일 레이블된 단백질을 표현 하는 셀에 대 한 관심의 형광 채널에서 최대 핵 횡단면으로 초점면을 선택 합니다. 셀에 대 한 단백질, 라는 표현 하지 또는 그 분명 핵 지역화 없이, 단계 대조 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미징을 사용할 수 있는 올바른 초점면을 찾아. ​ 참고: 단계 대조 및 DIC 이미징의 유용한 기능은 초점 비행기는 샘플을 통해 이동, 동일한 기능 또는 나타날 수 있습니다 빛 상대 초점면에 따라 어두운 하는 사실 이다. 핵소체, 같은 핵 내의 명확한 기능을 선택 하 고 모양에 있는이 변화를 관찰 하는 동안 아래로 초점면을 이동. 진정한 초점면 빛에서 어둠에 전환 내 거짓말을 합니다. 샘플을 집중 하는 선택 된 기능에 날카로운 대조 초점 평면을 선택. 관심 분야의 위치를 등록. 현미경 소프트웨어 내에서 3 x 3 픽셀 사각형 ROI, 만들고, 손상 될 셀의 핵이 투자이 수익을 놓고이 ROI ROI 손상 되도록 설정. 손상 투자 수익의 위치를 포함 하 여 사전 손상 이미지를 수집 합니다. 형광 단백질을 사용 하지 않는 실험 단계 대조 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 대물 이미지를 식별 하 고 핵 손상에 대 한 기록 취득 대. 라이브 셀 형광 단백질을 사용 하 여 실험에 대 한 명시와 형광 채널 관심 (즉, 레이저 라인 488 nm GFP, RFP의 여기에 대 한 레이저 라인 561 nm의 여기에 대 한)의 단백질을 포함 하는 이미지를 취득 합니다. 실험 조 K1 XRCC1 GFP를 사용 하 여, 형광 흥분된 488 nm 레이저 라인으로 동시에 수집 전송 DIC는 명시 야 채널. 시작 레이저 손상. 제시 시스템 제어 레이저 복용량 총 시간으로 보냈다 피해 ROI를 검색. 355 nm 레이저 검 류 계, 고정된 스캔 속도에서 작동 하기 때문에 레이저 복용량은 반복적으로 선택한 손상 ROI 검색 소요 시간에 의해 제어: 데이터에 여기에 제시 된, 마이크로-방사선 355에 nm는 2 초에서 10 초에 대 한 수행. 반면, 스캔 속도 변조 하 여 405 nm 레이저 복용량을 제어 하 고 선택 된 손상 ROI의 한 검색을 수행. 데이터 p마이크로-405에서 방사선에 대 한 8 및 0.5 fps를 사용 여기에 분개, nm. 레이저 스캔 하는 동안 각 픽셀에 적은 시간을 지출 하기 때문에 8 fps의 스캔 속도 0.5 fps 보다 낮은 레이저 복용량을 제공 합니다. 두 레이저는 100% 전력에서 운영 한다. 직접 레이저 전력 측정에 대 한 지침은 3.7 섹션을 참조 하십시오. 참고: 각 개별 현미경 시스템 지정 투자 수익, 어떻게 유사 355 레이저 파워를 전달 하는 방법에서 다를 수 있습니다 및 405 nm 제시 시스템에 다릅니다. 사용자가 그들의 현미경 시스템에 대 한이 절차를 확인 하 고 그들의 방법 섹션에서 이러한 매개 변수를 보고 해야 합니다. 라이브 셀 이미징에 대 한 명시와 형광 채널 timelapse 이미지 수집을 수행. 기간 및 데이터 수집, 이상적으로 실험의 시간 과정 동안 손상 ROI에 형광 단백질의 분리의 축적을 캡처 최적화 timelapse의 주파수를 조정 합니다. 실험 XRCC1 GFP를 사용 하 여 수집 이미지 20 분 30 초 마다. ​ 참고: timelapse 영상의 주파수 축적 및 분리 분석을 복잡 하 게 fluorophore의 photobleaching에 의해 제한 될 수 있습니다. Photobleaching는 timelapse 동안 손상 되지 않은 세포를 관찰 하 고 이러한 손상 되지 않은 세포에 형광 신호 손실을 최소화 하기 위해 인수 조건 조정 하 여 평가할 수 있습니다. 일부 photobleaching 수 있습니다 피할 수 있는, 그래서 사용자는 timelapse의 각 프레임에서 손상 되지 않은 세포의 손상 된 세포의 형광 강도 정상화 하 여 신호 손실에 대 한 보상 수 있습니다. 시간 과정을 완료 한 후 손상에 대 한 셀의 새 필드를 선택 하거나 섹션 4에서에서 설명한 대로 추가 분석에 대 한 손상 된 세포를 수정. 계속 마이크로-방사선 및 timelapse 이미징 손상 된 세포의 원하는 수에 도달할 때까지. ​ 참고: 유도 된 손상에 대 한 응답에서 셀 셀이 평가 선택한 조건 당 10-25 셀의 총을 손상 하는 것이 좋습니다. 대부분 confocal 시스템 사용자가 각 마이크로 조사 하는 동안 하나 이상의 셀을 손상 하면, 비록이 정열된 손상 개시 시간, 큰 수를 셀의 피크 모집 시간 분석을 복잡 하 게 수 또는 분리 시간 소개 빠른 이벤트에 대 한. 일부 시스템에서 여러 ROIs 이상 동시 손상 유도 각 독립적인 투자 수익을 받은 레이저 복용량을 줄일 수 있습니다. 따라서, 직접 사용자 이러한 타이밍/전원 문제를 해결 하지 않는 것이 좋습니다 셀 개별적으로 손상 될. 면역 (IF), 형광 분석 수행 손상 및 중 즉시에 설명 된 대로 셀, 수정 4, 또는 시간 (즉, 1, 5, 10 또는 20 분)의 선택 된 증가 복구 하는 세포를 허용. 원하는 시간이 지난 후 수정 하 고 섹션 4에서에서 설명한 대로 셀을 얼룩. 분석에 대 한 전반적인 세포 수를 증가, 손상 후 손상 응답의 다중 필드 시간 과정 생성 하 문화 선박 내에서 추가 필드를 . 손상이 발생 한 시간과 각 필드의 XY 위치를 기록 합니다. 원하는 총 후 시간 경과 복구, 수정 및 아래 설명한 대로 셀을 얼룩. 후 선택 된 복용량에 단백질 모집의 관찰, 측정 및 보고서 레이저 전력 레벨 후 섬유와 정확 하 게 특성화 하 고 보고 후 목표 레이저 복용량. 우리가 사용 하는 소형 디지털 파워 미터 및 2 개의 다른 포토 다이오드 센서 머리; 한 후 섬유 출력을 측정 하는 레이저 섬유에 직접 결합 하 고 다른 post-objective 출력 측정 현미경 스테이지에 배치. 레이저 파워를 측정 하는 센서 원하는 구성에 후 섬유 (post-objective) 놓고 전원 측정기에 의해 측정을 기록 하는 동안 위에서 설명한 대로 마이크로 조사를 수행 합니다. 파워 미터의 샘플링 속도 충분히 빨리 파워 미터 정확 하 게 적용 된 복용량을 감지 하도록 실험의 여러 반복을 실행 해야 할 수 있습니다 그래서 매우 빠른 마이크로 조사 이벤트를 잡으려고 하지 않을 수 있습니다 것을 유의. 참고: 355 nm 레이저에 대 한 약 5 mW 후 섬유와 약 19 µW 후 목표의 평균 피크 전력을 측정 했습니다. 405 nm 레이저에 대 한 마이크로-방사선의 파워 미터의 0.01 s 최대 샘플링 속도 1.5의 평균 피크 힘을 극복 하기 위해 30 반복 루프에서 수행한 mW 및 2.4 mW의 8, 0.5 프레임 / 초 스캔 속도 사용 하 여 측정 되었다 각각. 모든 파워 미터는 다릅니다. 사용자 운영 파장 및 그들의 개인 전원 측정기에 대 한 샘플링 속도 결정 해야 합니다. 4. 면역 형광 검사 절차를 얼룩 경우 얼룩에 의해 분석 가닥 휴식 유도. 수정 셀 3.7% 포름알데히드 (주의) 인산 염 (PBS) 10 분 Aspirate 포름알데히드 솔루션 및 PBS로 3 회 세척 버퍼링. 프로토콜 PBS 셀을 다시 배치 하 여 여기에 중지할 수 있습니다 및 셀 4 ˚C에 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다. 주의: 포름알데히드는 독성과 발암 성 이다. 착용 적절 한 개인 보호 장비 및 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시 되는 것으로 서 독성 물질의 dispose. 0.25%를 사용 하 여 세포를 permeabilize PBS로 3 회 10 분 실 온 (RT)와 다음 세척에서 PBS에 트라이 톤 X-100. 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실시간에서를 포함 하는 PBS에서 30 분 동안 배양 하 여 블록 일반적인 항 체 바인딩 53BP-1 둘 다 1:750 RT에 1 시간에 1 %BSA 포함 하는 PBS에 희석 후 PBS로 3 번 세척에 대 한 기본 polyclonal 항 체와 γH2AX에 대 한 기본 monoclonal antibody 품. 알 렉 사 488 염소 반대로 마우스와 알 렉 사 546 염소 안티 토끼 품 셀 1: 2000 RT에 1 시간에 1 %BSA 포함 하는 PBS에 희석와 다음 PBS로 3 회 세척. 얼룩 DAPI의 10 mg/mL 해결책 핵 DNA (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, 주의) 5 분, 또는 사용 하 여 유사한 핵 염료, PBS에서 1: 5000 희석 및 후 PBS로 3 회 세척. 주의: DAPI 독성 및 돌연변이 이다입니다. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시로 독성 물질 폐기. 장소 PBS 또는 PBS + 0.1% 나트륨 아 지 드 (주의) 스테인드 셀에 다시. 프로토콜 여기 중지 될 수 있습니다 및 셀 몇 일 동안 4 ˚C에 저장 하거나 섹션 5에서에서 이미지 수집. ​ 주의: 나트륨 아 지 드 이다 독성. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시로 독성 물질 폐기. 분석 유도의 기본 병 변 또는 DNA adducts 경우 얼룩에 의해. 수정 및 차가운 메탄올 (주의)-20에서 20 분 동안에 세포를 permeabilize ° c. 주의: 메탄올은 유독 하 고 가연성. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시로 독성 물질 폐기. 발음 나는thanol 15 분 프로토콜에 대 한 완전히 건조 샘플 여기 중지 수와 최대 3 일 동안 건조-20 ˚C에 저장 하는 셀. 15 분에 대 한 PBS에 셀 리하이드레이션 Denature RT와 PBS로 3 회 세척에서 45 분 2 N HCl (주의)를 사용 하 여 DNA. 주의: HCl 부식성입니다. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 제도적 환경 보건 및 안전 절차에 의해 지시 부식성 물질을 처리. PBS 가진 3 세척 뒤 5 분 동안 50 mM Tris HCl pH 8.8에에서 중화. 0.1%와 5% 정상 염소 혈 청 만들어진 블로킹 버퍼 품 세포 실시간에서 1 시간에 대 한 PBS에 트라이 톤 X-100 PBS로 3 회 8-옥 소-2´-deoxyguanosine (8-oxodG, 1:400) 또는 cyclobutane pyrimidine 이합체 (일일, 1:1, 000) RT, 및 다음 씻어 1 시간에 대 한 염소 혈 청 블로킹 버퍼에 대 한 1 차 항 체와 품. 셀 렉 488 염소 염소 혈 청 블로킹 버퍼에 RT, 1 시간에 1: 2000 비율에서 반대로 마우스를 품 어 그리고 PBS로 3 회 세척. 핵 DNA PBS에 5 분, 1: 5000 DAPI (10mg/mL)을 사용 하 여 얼룩 하 고 PBS로 3 회 세척. 경우 연 발된 coverglass를 사용 하 여 배치 PBS 또는 PBS + 0.1% 나트륨 아 지 드 스테인드 셀으로 다시. 프로토콜 여기 중지 될 수 있습니다 및 셀 몇 일 동안 4 ˚C에 저장 하거나 섹션 5에서에서 이미지 수집. 또는 추가 coverglass 문화 선박 위에 배치 될 수 있습니다 경우 기본 장착 매체에 셀을 탑재 합니다. 일단 치료, 탑재 된 셀 시간의 오랜 기간 동안 4 ˚C에 저장할 수 있습니다. 5. 면역 형광 검사 실험에 대 한 수집 이미지 에탄올 문화 선박의 coverglass 하단을 청소 하 고 다시 제자리에 confocal 현미경 단계. 위치 기록 손상 유도 되었다 때 방향에 해당 하는 방향과 무대에서 선박의 위치 확인 하십시오. 최적의 등록 및 영상 문화 선박 보안. 이전 몇 군데 찾기 필드 등록 기술을 사용 하 여 선택 (설명된에 3.2). 수동 등록에 대 한 에칭된 그리드와는 coverglass를 사용 하 여 가져올 그리드 포커스와 마크를 식별 하는 찾을. 사용 하 여 손상 된 세포를 찾으려고 XY 좌표를 기록 하는 다음. 이미지 기반 자동된 등록을 위한 단계, 3.2.1에서에서 참조로 사용 하는 구조적 기능 찾아서 다음 현재 라이브 현미경 보기 가능한 기록 된 이미지를 밀접 하 게 정렬. 일단, 현재 XY 현미경 단계 위치를 측정 하 고 참조 이미지의 XY 위치에 그것을 비교. 두 위치 사이의 선형 거리 X 및 Y 오프셋을 정의합니다. 이 오프셋 비친된 셀을 포함 하는 이미지 필드를 식별 하기 위해 각 기록 된 XY 위치에 적용 됩니다. 이 오프셋된 함수를 현미경 제어 소프트웨어에 자동 또는 수동으로 수행할 수 있습니다. 없는 적절 한 등록 포인트를 식별할 수 수동으로 슬라이드를 검색 하 고 이전 확인 된 셀 기능을 찾는 하 여 세포를 찾습니다. 명시 이미지 (섹션 2.3에에서 설정 하 고 섹션 3.3에서에서 초점)를 포함 하 여 모든 스테인드 목표를 수집 적절 한 현미경 설정을 사용 하 여 이미지. 제시 실험, 멀티 채널 이미지 다음 여기 레이저 라인 및 fluorophores 사용 하 여 수집 된: 405 nm (DAPI), 488 nm (알 렉 사 488 및 전송된 DIC는 명시 야), 그리고 561 nm (알 렉 사 546). 모든 레이저 레이저 파장 및 힘의 전송 제어 단일 acousto 광학 가변 필터 통과. 6. 라이브 사이트 마이크로 반구에 형광 단백질의 신규 모집의 셀 이미지 분석 오픈 (즉, NIS 요소 또는 ImageJ) 이미지 분석 응용 프로그램에서 이미지를 획득. 필요한 경우, 사전 및 사후 손상 유도의 단일 이미지 시퀀스를 생성 timelapse 이미지 사전 조사 이미지를 결합. 사용자가 보여줄 수 있는 채용 조사 영역 형광 강도에 변화를 측정 하 여 전체 핵에 걸쳐 측정 하는 형광 강도를 상대 (대표 결과 그림 1 참조 B. ). 측정 각 셀에 대 한 먼저 핵을 나타내는 투자 수익에 대 한 참조를 생성. 핵을 구성 하는 픽셀을 포함 하는 형광 신호에 임계 처리 알고리즘을 사용 하 고은 투자 수익으로이 영역을 변환. 필요한 경우, 투자 수익 기준으로는 관찰법을 사용 하 여 수동으로 그릴 수 있습니다. 핵 지역은 정확 하 게는 투자 수익에 의해 덮여 되도록 시간 동안 투자 수익을 조정 하 고 각 프레임에 대 한이 투자 수익 내 형광 신호의 평균 형광 강도 보고. 측정 각 셀에 대 한 6 x 6 픽셀 ROI 만들고 시간 과정의 각 프레임에 대 한 투자 수익 손상 위에 놓습니다. 이 더 큰 ROI 분석에 대 한 손상 ROI 지금 이다. 각 프레임에 대 한 평균 투자 수익 형광 강도 보고. 참고: 대부분의 상용 이미지 분석 소프트웨어는 2D 개체 추적 모듈 그리고 빠른 워크플로 및 높은 처리량 (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ 참조) ImageJ 또는 피지에 대 한 사용자 개발 매크로 많습니다. 평균 피해 투자 수익 형광 강도 timelapse의 각 프레임에 해당 참조 투자 수익의 정상화. 여기, 말은 핵 형광 강도 참조 ROI로 사용 됩니다 (대표 결과 그림 1 참조). 정규화 평균에서 평균 참조 ROI 형광 강도 빼서 수행할 수 있습니다 투자 수익 형광 강도, 손상 하거나 의미를 나누어 손상 ROI ROI 형광 강도 의미 참조로 형광 강도. 참고: 정규화 사단에 의해 얻을 수 있습니다 예측할 수 없는 결과, 매우 낮은 기준 강도 값에 사용 하는 경우. 적어도 두 개의 제어, 손상 되지 않은 셀 뿐 아니라 모든 손상 된 세포에 대 한 반복합니다. 필요한 경우 추가 정규화에 대 한 제어 셀 결과 사용할 수 있습니다. 그래프 실험적인 치료의 기능으로 모집 역학에서 변경 내용을 표시 하는 시간이 지남에 강도 값을 정규화. 7. 면역 형광 검사에 의해 감지 단백질 모집의 분석 이미지 이미지 분석 응용 프로그램에서 오픈 사전 및 사후 피해 이미지. 사전 손상 이미지 손상 ROI(s) 마이크로 조사에 대 한 사용 포함. ROI(s)을 복사 하 고 붙여넣이 대상된 셀을 식별 후 손상 이미지. 는 단백질 모집의 분석에 대 한 6 x 6 픽셀 투자 수익을 생성 하 고이 투자 수익 ROI 손상의 위치에 배치. 이 더 큰 ROI 분석에 대 한 손상 ROI 지금 이다. 평균 피해 투자 수익 형광 강도 보고. 해당 참조 투자 수익의 말은 피해 투자 수익 형광 강도 정상화. 여기, 손상 된 세포의 평균 핵 형광 강도 ROI 참조로 사용 됩니다 (대표 결과 그림 1 참조). 핵, 정의 DAPI 신호에 임계 처리 알고리즘을 사용 하 여 참조 투자 수익을 생성 하 고이 분야는 투자 수익에 변환. 투자 수익 형광 강도 의미 참조를 보고 합니다. 정규화 수행 평균 피해 투자 수익 형광 강도에서 평균 참조 ROI 형광 강도 빼서 하거나 평균 피해 투자 수익 형광 강도 나누어 투자 수익 형광 강도 의미 참조로. 참고: 정규화 사단에 의해 얻을 수 있습니다 예측할 수 없는 결과, 매우 낮은 기준 강도 값에 사용 하는 경우. 모든 손상 된 세포를 반복 하 고 위에서 설명한 대로 적어도 두 개의 셀에 같은 분석을 수행. 그래프 각 실험 치료의 기능으로 단백질 모집 또는 DNA 손상의 종류에 변화를 표시 하는 시간에 대 한 마이크로 조사 이벤트 측정에 대 한 강도 값을 정규화.