تطبيق الليزر الجزئي-التشعيع لدراسة واحدة ومزدوجة حبلا كسر إصلاح في خلايا الثدييات
Summary
الأسفار [كنفوكل] مجهرية والليزر أدوات العرض الجزئي-التشعيع لإحداث ضرر الحمض النووي، ورصد الاستجابة للبروتينات إصلاح الحمض النووي في المجالات النووية الفرعي المحدد. هذا الأسلوب قد دفعة قوية لمعرفتنا بالكشف عن الأضرار، والإشارات، والتوظيف. هذه المخطوطة يوضح هذه التكنولوجيات لدراسة إصلاح كسر حبلا مفردة ومزدوجة.
Abstract
وتوجد مسارات إصلاح الحمض النووي درجة عالية من التنسيق لكشف والمكوس واستبدال التالف قواعد الحمض النووي، وتنسيق إصلاح فواصل حبلا الحمض النووي. بينما يكون توضيح تقنيات البيولوجيا الجزيئية هيكل ووظائف الانزيمية والحركية لإصلاح البروتينات، لا تزال هناك حاجة لفهم كيف يتم إصلاح منسقة داخل النواة. الليزر الجزئي-التشعيع يوفر أداة قوية لإحداث أضرار الحمض النووي ورصد تجنيد إصلاح البروتينات. تحريض تلف الحمض النووي بالليزر الجزئي-التشعيع يمكن أن تحدث مع مجموعة من الأطوال الموجية، وموثوق بها يمكن أن يستحث المستخدمين فواصل جديلة واحدة وآفات قاعدة مزدوجة حبلا فواصل مع طائفة من جرعات. هنا، يستخدم الليزر الجزئي-التشعيع لدراسة إصلاح واحد وضعف حبلا فواصل الناجمة عن موجات ليزر [كنفوكل] المشتركة اثنين، 355 نانومتر و 405 نانومتر. ويرد توصيف المزيد والسليم من جرعة الليزر التطبيقية لحفز الخلائط أضرار محددة، حيث يمكن للمستخدمين تنفيذ تكاثر الحصول على البيانات الدقيقة-التشعيع الليزر والتحليل.
Introduction
مجهر فلوري برز كتقنية قوية لتصور البنية الخلوية ودراسة التعريب البروتين، ورصد تفاعلات البروتين البروتين والبروتين-الحمض النووي. استخدام مجهر فلوري لدراسة الردود تلف الحمض النووي بعد تطبيق الحمض النووي العالمي إتلاف عوامل، مثل الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء، الإشعاعات المؤينة، والأكسدة الكيميائية أو وكلاء alkylating، و/أو تشريعات وفرت ثاقبة جديدة بدء، إشارات، والتجنيد للحمض النووي إصلاح البروتينات إلى مواقع الحمض النووي الضرر1،2. ومع ذلك، تحد هذه العالمية والأضرار بأحداث متزامنة إذا معلومات مفصلة حول أمر التعيين، حركية الارتباط أو الانفصال، ويجري البحث عن العلاقات بين البروتينات إصلاح الحمض النووي الرئيسية. لحسن الحظ، التقدم في ليزر المسح مجاهر [كنفوكل]، توفر أوسع نطاقا من موجات الليزر يحفز الضرر، والتحسينات في البروتينات الفلورية على مدى السنوات ال 25 الماضية قدمت الباحثين مع أدوات محسنة لدراسة هذه إصلاح جوانب من الحمض النووي، عن طريق الاستقراء أضرار الحمض النووي المستهدف.
تشعيع الخلايا التي تحتوي على microbeams الليزر من أجل دراسة وظائف الخلايا وسوبسيلولار أداة راسخة في بيولوجيا الإشعاع والخلية3. تطبيق هذه التقنية لدراسة إصلاح الحمض النووي ظهرت عند استخدام الأشعة فوق البنفسجية درجة عالية من التركيز كريمر وزملاء العمل (257 nm) نظام ميكروبيام الليزر للحث على أضرار الحمض النووي أكثر 0.5 ميكرومتر بقعة في الهامستر الصيني المبيض (شو) خلايا4 والمنشأة تحريض الحمض النووي فوتوليسيونس بهذا النظام5. في حين تقدم تحسينات كبيرة على أساليب ميكروبيم الأشعة فوق البنفسجية في الوقت، اعتماد هذا إتلاف النظام كانت محدودة بسبب إعداد متخصصة، وقدرتها على توليد فواصل حبلا مزدوجة (دسبس)6. التحقيق اللاحق لمجموعة متنوعة من الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية-باء (290-320 nm)-كشف الأطوال موجية (320-400 نانومتر) بعدد من المجموعات أن الأشعة فوق البنفسجية برومة، عنصر مؤكسد قاعدة الآفات، فواصل جديلة واحدة (SSBs)، ويمكن أن يتسبب دسبس تعتمد على الطول الموجي الليزر و تطبق السلطة4،،من78،9،10 (إعادة النظر في 3). علاوة على ذلك، تركيبات من هذه الأشعة فوق البنفسجية-باء وأطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية-أ مع توعية وكلاء، مثل سورالين، بروموديوكسيوريديني (بردو)، والأصباغ هويشت، عثر أيضا للحث على أضرار الحمض النووي يعتمد على الطول الموجي، والطاقة، ومدة التعرض، على الرغم من أن السلطة بحاجة إلى حمل غالباً ما يخفض الضرر حضور هذه العوامل12،11،13،،من1415. هذه التطورات بتوسيع نطاق استخدام مايكرو-التشعيع، على الرغم من وجود عقبات فنية لا يزال يتعين معالجتها للتوسع في اعتماد هذه الأساليب.
كريمر وزملاء العمل دفعة قوية لمجال تشعيع الصغرى بالتحديد التركيز ميكروبيم الأشعة فوق البنفسجية لتطبيق الطاقة ضررا كبيرا على منطقة عالية مترجمة في الخلية. كما نظم الليزر ميكروديسيكشن ومجاهر [كنفوكل] متقدمة, الضوء تركيزاً كان موجوداً على نطاق أوسع؛ ومع ذلك، أن اقتران مصادر الأشعة فوق البنفسجية إلى نطاقات والتعامل مع الانحرافات اللونية التي يتسبب فيها أنها لا تزال تحديات كبيرة لمعظم المستخدمين3،،من616. صبغات الأشعة فوق البنفسجية زادت شعبية طوال عقد التسعينات، البصريات قادرة على التركيز والالتقاط fluorescence متحمس الأشعة فوق البنفسجية وأصبحت متاحة على نطاق واسع16، والتحسينات في ليزر المسح عرض المستخدمين القدرة على إنشاء عالية تركز الأشعة فوق البنفسجية البقع الإثارة داخل الخلايا6،17. ومع ذلك، لم يكن حتى أوائل 2000s أن التأثير الحقيقي لهذا المزيج من عوارض تركيزاً مع أعلى كثافة الليزر شعر، عندما ظهرت تقارير عديدة تثبت أن فواصل حبلا الحمض النووي يمكن أن يتسبب مع أو بدون محسسات في نطاق الأشعة فوق البنفسجية-أ6،10،18،،من1920، 405 نانومتر21،،من2223،24، 26من 25،، وحتى في فترة أطول موجات مرئية مثل 488 نانومتر27. هذه التطورات التي تسمح باعتماد تقنية التشعيع الصغرى في عدد من النظم التجارية أكثر انتشارا. وبالتوازي مع هذه التطورات، ظهرت تقنيات اثنين-فوتون أيضا السماح للاستقراء الدقيق من تلف الحمض النووي؛ على الرغم من أن هذه التطورات لن تناقش هنا، هناك عدد من المقالات الاستعراض مناقشة هذه المنهجيات9،28،،من2930.
مع إمكانية الوصول إلى الحالي مجاهر [كنفوكل] القادرة على ضوء الأشعة فوق البنفسجية شديدة التركيز وتوافر البروتينات الفلورية للسماح بتتبع في الوقت الحقيقي من البروتينات إصلاح الحمض النووي على نطاق واسع، قد تطورت تقنيات التشعيع الصغرى أدوات قوية لدراسة مسارات استجابة وإصلاح أضرار الحمض النووي. ومع ذلك، يحتاج المستخدمون إلى يجب أن تدرك أن تعتمد اعتماداً كبيرا على طول موجه الليزر والطاقة المطبقة على المنطقة النووية دون توليد ضرر الحمض النووي. استخدام الأشعة فوق البنفسجية-ج (~ 260 nm) أطوال موجية تسمح مباشرة الحمض النووي الإثارة وانتقائية عالية لاستحثاث الأشعة فوق البنفسجية برومة7،8. الأشعة فوق البنفسجية-باء وأطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية-أ إنتاج مخاليط تلف الحمض النووي (الآفة الأساسية و SSBs دسبس)، التي تعتمد على قوة التطبيقية والخلفية الخلوية تستخدم7. الضيائية الذاتية ومستويات مضادات الأكسدة في الخلايا المستهدفة يمكن أن تؤثر الخلائط تلف الحمض النووي التي تنتجها هذه الأطوال الموجية. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الضيائية خارجية (بردو، إلخ) يمكن أن تساعد في خفض الطاقة اللازمة لاستحثاث تلف الحمض النووي. ومع ذلك، هذه العوامل يمكن حمل الحمض النووي الضرر بأنفسهم، وأنهم قد يغير دورة الخلية وهيكل الكروماتين، حيث أن استخدامها قد تحدث آثاراً غير مرغوب فيها التي يتعين النظر فيها من قبل المستخدم. ولذلك، قبل استخدام التشعيع الجزئي لدراسة استجابة ضرر الحمض النووي، وإصلاح، النظر بعناية في مسار إصلاح الحمض النووي للفائدة وأطوال موجية متوفرة للاستخدام، والخليط تلف الحمض النووي التي تم إنشاؤها مطلوب.
هنا، يتم إجراء الليزر الجزئي-التشعيع عند أطوال موجية استخداماً اثنين، 355 نانومتر و 405 نانومتر، دون محسسات لإثبات الخلائط الحمض النووي الضرر الناجم عن هذه الأطوال الموجية وتأثيرات هذه المخاليط الضرر يكون على دراسة الإصلاحSSBs ودسبس. المستخدمين يجب أن تدرك أن هذه الأطوال الموجية لا تقم بإنشاء نوع واحد من فواصل حبلا أو الآفات الأساسية. كي تميز بين مسارات إصلاح الحمض النووي، المستخدمين يجب بعناية سيطرة القوة المطبقة على منطقة محددة من النواة وتوصيف الأضرار العمدي باستخدام عدة علامات فاصل حبلا والأجسام المضادة للآفة الحمض النووي. إذا أحسن تطبيقها وتتميز، يمكن أن تثري الليزر الجزئي-تشعيع بعض الأنواع من ضرر الحمض النووي، مما يسمح للمستخدمين لتقييم إصلاح قاعدة الآفات و SSBs أو دسبس، مع بعض الخصوصية. ولذلك، فقد وفرنا أسلوب يسمح للمستخدمين بإجراء الليزر الجزئي-التشعيع تكاثر وتوصيف الخلائط تلف الحمض النووي الناجم عن جرعة الليزر التطبيقية، والقيام بتحليل البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الشروط الموضحة هنا، أي مجهر [كنفوكل] مع الأشعة فوق البنفسجية-أ أو 405 نانومتر الليزر، أما المتكاملة حسب الشركة المصنعة أو إضافتها بواسطة المستخدم النهائي، يمكن أن تحفز تلف الحمض النووي داخل نواة الخلية والسماح بتجنيد البروتينات إصلاح الحمض النووي إلى موقع الناجم عن تلف الحمض النووي التي يتعين رصدها. ومع ذلك، كما ذكر في البروتوكول والنتائج التمثيلية، واختيار الطول الموجي، تطبق السلطة، وتوصيف الأضرار جميعها بأهمية المسائل التي يجب معالجتها أولاً قبل المستخدم من أجل دراسة الحمض النووي خاصة إصلاح الطريق. بالإضافة إلى ذلك، هناك اعتبارات أخرى في تصميم التجارب التي يجب أن تنظر أيضا إلى المستخدمين.
بغية مراقبة السلوك للبروتين في وظيفة الخلايا الحية الدقيقة-التشعيع، بروتين مسمى فلوريسسينتلي يجب إنشاء. توفر مجموعة واسعة من البروتينات الفلورية التي يمكن فصلها طيفيا يوفر أدوات لخلق اندماج البروتين التي يمكن استخدامها لوصف الاستجابات الخلوية لاستحثاث تلف الحمض النووي. تعداء عابرة من البروتينات الفلورية ذات الاهتمام يسمح للفحص السريع لظروف ضارة، والطفرات، أو حتى مثبطات، بينما تقدم ستابلي transfected الخلايا المزيد من السيطرة على مستويات التعبير والسماح للكيمياء الحيوية الأخرى الأوصاف التي يمكن القيام بها، التحقق من صحة النتائج الدقيقة-التشعيع. يمكن أيضا الاستفادة من البروتينات الفلورية طيفيا متميزة في نفس الخلية لرصد التفاعلات بين البروتينات داخل المسار نفسه، أو في مسارات مختلفة. البروتينات الفلورية أيضا القضاء على الحاجة إلى أجسام مضادة محددة لكل البروتين من الفائدة والسماح بخلية حية رصد السلوك البروتين لفترات طويلة من الزمن بعد التعريفي للضرر.
ومع ذلك، قد استخدام البروتينات الفلورية أيضا عيوب. دون الخلفيات الوراثية ناقصة في protein(s) للفائدة، سوف تتنافس البروتينات الذاتية مع البروتينات المعلمة فلوريسسينتلي. تصريف علامة مضيئة للمحطة N أو ج من البروتين قد يغير طي البروتين، ويعوق تفاعلات البروتين البروتين الرئيسية، أو منع إشارات إزفاء؛ تغيير الدالة ويحتمل أن تؤثر على ديناميات التوظيف. أثبتت هذه الآثار في عدد من التقارير تلطيخ إيممونوفلوريسسينت أثبت فيها توظيف مختلفة إلى حد كبير ومرات الاحتفاظ للبروتينات الذاتية في موقع الضرر28. استخدام تعداء عابرة أو استنساخ مستقرة أيضا تغيير الاستجابة لاحظ، عادة من خلال التغيرات في مستويات التعبير البروتين. علاوة على ذلك، استخدام البروتينات الفلورية متعددة في تجربة واحدة قد تغير أيضا القوى المحركة للتوظيف، إذا لم يتم اكويليبراتيد مستويات البروتين جيد أو إذا كان توظيف البروتين فلوريسسينتلي معلم أكبر يمنع تجنيد البروتينات الأخرى . وأخيراً، يمكن أن تعمل البروتينات الفلورية كعوامل التوعية ضعيفة، وتزايد تشكيل الأنواع الأكسجين التفاعلية، واحتمال تغيير الحمض النووي الضرر الخلائط المستحث46،47. وعلى الرغم من هذه العيوب، توفر البروتينات الفلورية إصلاح عدد من مزايا واضحة في دراسة الحمض النووي مع التشعيع الصغرى، وإذا كان المستخدمين إدراج عناصر التحكم المناسبة، مثل وصف الضرر الموصوف هنا، أنها يمكن أن تقدم نظرة جديدة إلى تلف التفاعلات استجابة والبروتين-بروتين3.
إذا كان غير مطلوب تصوير الخلايا الحية، يمكن استخدام الفلورة لرصد الاستجابة للأضرار العمدي. عن طريق تحديد الخلايا في أوقات محددة بعد التعريفي الأضرار وتلطيخ مع الأجسام المضادة المحددة للبروتينات وآفات الفائدة، ولقطات ثابتة من الضرر التعريفي والتوظيف والاحتفاظ بإصلاح يمكن أن يبني البروتينات. يمكن استخدام الأجسام المضادة لرصد تجنيد البروتينات متعددة الفوائد و/أو التعديلات بوستترانسلاشونال الناجمة عن الاستجابة تلف الحمض النووي. استخدام الفلورة يلغي الحاجة للبروتينات الفلورية، ويسمح للسلوك البروتين الذاتية لفحصها. ومع ذلك، هذا الأسلوب أيضا عيوبها. ضرورية أجسام مضادة محددة للغاية، وبيرميبيليزيشن وإجراءات حظر بحاجة إلى أن يكون الأمثل للسماح للكشف عن التوظيف بكثافة إشارة كافية. تحديد إجراءات ليست لحظية، ويحد هذا القيد المادي القرار الزماني لهذا النهج. تعيين موقع التعريفي الضرر حتى يمكن أن تكون الخلايا إعادة يقع بعد تلطيخ يمكن أيضا تحديات كبيرة. المجهر [كنفوكل] المستخدمة في هذا العمل يسمح للتسجيل المستندة إلى الصور كما هو موضح أعلاه، حيث يمكن نقل الخلايا التالفة بدقة عالية. إذا كانت مرحلة التسجيل أو محفوراً كوفيرجلاس غير متوفرة، وقت الاستثمار تشارك في نقل الخلايا دون تسجيل المرحلة، مقترنة بالتأخير المتأصلة بين الضرر التعريفي وتجنيد المصورة، قد جعل الفلورة غير جذابة لبعض المستخدمين. ومع ذلك، سيتضمن التصاميم التجريبية الصغيرة-التشعيع الأكثر دقة واكتمال هذه الأنواع من نهج بالتوازي مع استخدام البروتينات الفلورية، كما هو موضح في البروتوكول المقدم.
هنا، يستخدم تصوير الخلايا الحية والفلوره لإثبات جدوى الليزر الجزئي-التشعيع. تلوين إيممونوفلوريسسينت يسمح لنا ببحث دقيق خليط تلف الحمض النووي التي تم إنشاؤها وتجنيد البروتينات التي يتسبب فيها بكل قوة الليزر، التي تسمح لنا بشكل أفضل تفسير التعديلات الملحوظة في التوظيف والاحتفاظ XRCC1-التجارة والنقل. وبناء على هذه النتائج، ينبغي استخدام 405 نانومتر الليزر المحدودة لدراسة البروتينات البر وسبر. علاوة على ذلك، أفضل تصميم تجريبية تشمل قياسات الطاقة بعد الهدف، وتوصيف خليط الضرر الكامل لكل خط الخلية المستخدمة، والتحقق من التوظيف واستبقاء الملاحظ في فلوريسسينتلي معلم البروتينات مع الفلورة. ومن الواضح أن المعدات والوقت، واعتبارات التكلفة قد يجعل هذه التصاميم التجريبية الأمثل المستحيل لبعض المستخدمين. بيد أن أهمية كل عنصر من هذه العناصر تتجلى هنا والمستخدمين يجب أن نأخذ هذه الاعتبارات في الاعتبار عندما تبدأ التجارب الصغرى-التشعيع.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر الدكتور صمويل حاء ويلسون في “الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية” لخطوط الخلايا المستخدمة في هذا العمل.
Materials
| Nikon A1rsi laser scanning confocal microscope | Nikon | ||
| NIS Elements software | Nikon | ||
| 355 nm laser | PicoQuant VisUV | Radiation source | |
| Galvanometer photoactivation miniscanner | Bruker | ||
| Microscope slide photodiode power sensor | THORLabs | S170C | |
| Fiber photodiode power sensor | THORLabs | S150C | |
| Digital handheld optical power and energy meter | THORLabs | PM100D | |
| CHO-K1 | From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS | ||
| Minimal essential media | Hyclone | SH3026501 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta biologicals | S11550 | |
| XRCC1-GFP | Origene | RG204952 | |
| Jetprime | Polyplus transfection | 11407 | |
| Geneticin | ThermoFisher | 10131035 | |
| 4 chambered coverglass | ThermoFisher | 155382 | |
| 8 chambered coverglass | ThermoFisher | 155409 | |
| Anti 53BP-1 | Novus | NB100304 | |
| Anti-phospho-histone H2AX | Millipore | 05-636-I | |
| Anti cyclobutane pyrimidine dimer | Cosmo Bio clone | CAC-NM-DND-001 | |
| Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine | Trevigen | 4354-MC-050 | |
| Alexa 488 goat anti-mouse | ThermoFisher | A11029 | |
| Alexa 546 goat anti-rabbit | ThermoFisher | A11010 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | R37606 | Caution toxic! |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher | 0780 | |
| Normal goat serum | ThermoFisher | 31873 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| 37% Formaldehyde | ThermoFisher | 9311 | Caution toxic! |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Methanol | VWR | BDH1135 | Caution toxic! |
| HCl | Fisher | SA49 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Caution toxic! |
| Tris Hydrochloride | Amresco | O234 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referencias
- Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
- Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
- Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser–UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
- Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, 71-75 (2003).
- Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
- Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68 (2009).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
- Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
- Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
- Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
- Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
- Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
- Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
- Stelzer, E. H. K., Haar, F. -. M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
- Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
- Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301 (2012).
- Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
- Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
- Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
- Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
- Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
- Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
- Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
- Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, 4153-4162 (2005).
- Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
- Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
- London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
- Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
- Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
- Cooke, M. S., Lunec, J. . Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , 275-293 (2003).
- Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
- Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
- Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
- Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
- Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
- Lomax, M. E., Gulston, M. K., O’Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
- Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059 (2011).
- Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
- Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation–towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, 1621-1629 (2014).
- Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).
