Универсальный протокол для крупномасштабных gRNA библиотека производства из любого источника ДНК

1. пищеварение ДНК с Микрококковая Нуклеаза Выполните оптимизация реакции для каждой новой партии Микрококковая Нуклеаза фермента (MNase).Примечание: Количество единиц MNase используется должны испытываться (с помощью последовательного разрежения, рис. 2A). Как правило 5-10 U MNase дайджест 1 мкг очищенного геномной или дна BAC вплоть до диапазона 5-100 bp с соблюдением условий, описанных ниже. В реакции, настройка 1 мкл 10 x буфер MNase, 1 x бычьим сывороточным альбумином (БСА), 1 мкг целевого ДНК, 1 мкл MNase (0,1-50 единиц) в объеме 10 мкл реакции. Инкубируйте при 37 ° C 15 мин. Сразу же инактивирует фермент, добавив 1 мкл 500 мм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic кислота (EGTA). 2. разделение ДНК фрагментов с помощью электрофореза геля полиакриламида (страница) Добавить пример буфера/гель загрузки краситель для образцов ДНК и загрузить на 20% гель страницы. Загрузить соответствующий трап дна для калибровки (5 bp лестница ДНК). Не перегружайте геля (1 мкг ДНК на хорошо). Запустите гели в соответствующих 1 x работает буфер TRIS-Борат-ЭДТА (КЭ) 150 V (константа) для около 1,5 ч или до нижней краситель фронт (бромфеноловый синий, темно синего цвета), который путешествует в около 15 bp, достигает нижнего конца геля. Пятно гель с использованием ультра-чувствительных нуклеиновых кислот пятна и визуализировать под УФ светом. Из образа гель определите оптимальную концентрацию MNase усваивая ДНК вплоть до 20-30 bp в размер. Используйте оптимизированные концентрации MNase усвоить дна цели, повторив шаги 1.2-2.2. Как правило Настройка 10-12, которую реакций (т.е. 10-12 мкг всего исходного материала) даст достаточно переваривается ДНК после извлечения геля страницы перейти к последующим шагам. С помощью стерильным скальпель, вырезать гель рядом с маркером Лейн и пятно только часть гель, содержащий лестница с свежий 1 x TBE идущий буфер, содержащий 1 X пятно сверхчувствительных нуклеиновых кислот. Визуализировать ДНК лестница и акцизных фрагментов ДНК, MNase переваривается в диапазоне размеров между приблизительно 18-30 bp с помощью лезвия бритвы.Примечание: Не подвергайте MNase переваривается фрагментов к ультрафиолету. Это можно использовать синий источник света (вместо УФ) или принять изображение лестницы под УФ, распечатать его и использовать это для вырезания фрагментов ДНК, MNase усваивается). Этот шаг позволяет избежать окрашивания и фрагментов ДНК подвергаются воздействию УФ-излучения. Всегда используйте неиспользованные, стерильные одноразовые скальпелем или лезвием для этого шага, чтобы избежать загрязнения. Передать среза геля пробки microcentrifuge. Пятно на оставшуюся часть геля с пятен нуклеиновой кислоты как выше, подвергать ультрафиолетового света и записывать изображение, чтобы сохранить запись иссечение шаг гель. 3. изоляция фрагментов ДНК с помощью раздавить и замочить метод страницы гели Примечание: Этот шаг был принят от Sambrook и др. 11 Подготовка страницы гель солюбилизация буфера (1.88 мл 4 М аммония ацетат, 150 мкл магния ацетат 1 М, 30 мкл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (рН 8) в сверхчистого H2O к общим объемом 15 мл). Раздавить подакцизным гель ломтик против стены микро пластиковых пробирок, используя кончик стерильной пипеткой. Добавьте 2 гель томов страницы солюбилизация буфера и инкубировать при 37 ° C для 16 h на вращающейся платформе. Центрифугуйте образцы на 1 мин на максимальной скорости в microcentrifuge. Супернатант передать новой microcentrifuge трубки, заботясь не передавать любой части измельченных гель. Добавить 0,5 томов страницы буфера солюбилизация гель Пелле, вихрь и повторять центрифугирования (шаг 3.4). Объединить supernatants. Извлечения фрагментов ДНК с помощью стандартного фенол хлороформ добычи.Предупреждение: Фенол является токсичным, если он вступает в контакт с кожей или проглатывании. Меры предосторожности как перчатки, защитные очки, лаборатории пальто и работающих в вытяжного шкафа имеют решающее значение. Утилизация всех отходов, содержащих фенол, согласно правилам института. Добавьте один объем фенола: хлороформ: изоамилового спирта (25:24:1) образца и вихревой тщательно. Центрифуги для 10 мин на максимальной скорости (16000 x g) в настольной центрифуги при комнатной температуре. Тщательно передать свежие microcentrifuge трубки верхняя водной фазе. Заботиться не проводить над любой фенола во время закупорить. Повторите шаги 3.6.1 и 3.6.2 один раз. Добавить небольшое количество гликогена, 0.1 объемы ацетат натрия 3 M (рН 5.2) (0.2 мкл) и 2 тома 100% этанола (EtOH). Вортекс и инкубировать при-20 ° C на несколько часов или на ночь. Центрифуги для 30 мин на максимальной скорости на 4 ° C, с помощью настольной центрифуги. Тщательно удалить супернатант и помыть лепешка ДНК с 70% EtOH. Центрифуги для 30 мин на максимальной скорости на 4 ° C, с помощью настольной центрифуги. Удалить супернатант и просушите Пелле ДНК. Убедитесь, что все EtOH испарилась, но будьте осторожны, чтобы не слишком сухие гранулы. Растворяют гранулы ДНК в 12 мкл H2O.Примечание: Страница извлечения геля очень неэффективно. За каждые 10 мкг начиная ДНК переваривается с MNase ожидаете, чтобы восстановить 1-20 нг очищенный фрагментов после извлечения геля. Контролировать количество и сохранность фрагментов путем загрузки 1/6-й (2 мкл) на странице гель (рис. 2 c). 4. конец ремонт MNase переваривается, гель очищенная фрагментов Созданы следующие реакции с использованием ДНК притупления комплект: 10 мкл очищенная ДНК из шага 3.6.10, 1,5 мкл 10 X притупления буфера, 1.5 мкл dNTP смеси 1 мм, 0,6 мкл притупления фермента, 1.4 мкл H2O. Инкубируйте на 22 ° C в течение 30 мин, а затем тепло инактивирует фермент по инкубации при 70 ° C на 10 мин. Мкл 85 H2O и выполнить реакции очистки с помощью стандартного фенол/хлороформ добыча и EtOH осадков (как описано в разделе 3.6). Немедленно приступить к компоновщика перевязки. 5. компоновщика поколение Примечание: Линкеры нужно усиливается параллельно с разделом 3, чтобы иметь возможность немедленно приступить к компоновщика перевязки. Грунтовка последовательности используется ниже должны быть подходящими для выбранной gRNA вектора выражения. Представленные здесь были разработаны для векторных pgRNA-pLKO.1. 9 для амплификации компоновщик 5′ от pgRNA-pLKO.1, используйте грунт последовательности 5′-компоновщик F (TTGGAATCACACGACCTGGA) и 5′-компоновщик R (CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC), уступая 689 ампликон bp. Для усиления компоновщик 3′ от pgRNA-pLKO.1 Используйте праймеры 3′-компоновщик F: (GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATA) и 3′-компоновщик R: (ACTCGGTCATGGTAAGCTCC), которые дают 848 ампликон bp. ПЦР усилить адаптер последовательностей из вектора выражения gRNA (с использованием реагентов выбора и последовательности пользовательских грунт, при необходимости). Для pgRNA-pLKO.1, созданы следующие реакции PCR 50 мкл: 25 мкл мастер смеси ПЦР, 2.5 мкл праймера F (10 мкм), 2,5 мкл грунтовка R (10 мкм), 0.1 нг gRNA вектора выражения (pgRNA-pLKO.1) в H2O. Инкубировать реакции на Термоциклер с использованием следующих условий: 1 цикл 98 ° C за 30 s, 32 циклов 98 ° C 10 s, 59 ° C 10 s, 72 ° C для 30 s, 1 цикл 72 ° C для 10 мин. Очищайте ПЦР-реакции с использованием твердой фазы реверсивные иммобилизации бусины согласно инструкциям производителя. Элюировать в 30 мкл H2O. Для обеспечения соблюдения направленного лигирование компоновщику фрагментов ДНК конце отремонтированы, MNase переваривается, дайджест линкеры с соответствующим энзимами ограничения (здесь ХиндIII и SacII). Установите следующие реакции: Для переваривания 5′ компоновщик с ХиндIII, используйте 30 мкл очищенная 5′ компоновщика ампликон из шага 5.3., 5 мкл буфера, 3 мкл ХиндIII (20U/мкл) и 12 мкл H2O. Для переваривания 3′ компоновщик с SacII, используйте 30 мкл очищенной 3′ компоновщика ампликон из шага 5.3., 5 мкл буфера, 3 мкл SacII (20 U/мкл) и 12 мкл H2O. Инкубируйте дайджесты при 37 ° C в течение 3 ч. Добавить ДНК гель загрузки красителя и запустить дайджесты энзима ограничения на геле агарозы 1%. Акцизный полосы в 637 bp (5′ компоновщика дайджест) и 295 bp (3′ компоновщика дайджест). Очищайте ДНК из кусочков подакцизным гель, используя набор для извлечения геля. 6. компоновщика перевязки и усиления вставок Настройка реакции перешнуровки 14 мкл, используя эквимолярных количествах MNase переваривается, отремонтированы конец фрагментов и компоновщик последовательности.Примечание: Компоновщику фрагмент соотношения могут быть оптимизированы. Рекомендуется включить без фрагмент контроля (NFC) реакции. Использование 5 нг MNase переваривается фрагментов (конец отремонтированы и очищенного), 120 нг 5′ компоновщика (ХиндIII дайджест, очищенный), 55 нг 3′ компоновщик (SacII дайджест, очищенный), 1.4 мкл T4 лигаза буфера и 1.4 мкл концентрированного T4 ДНК лигаза в H2O. Инкубируйте реакции перешнуровки в 16 ° C для 16 h. Делать не тепло инактивирует фермент. Немедленно приступить к Ник перевод.Примечание: Фрагменты переваривается MNase конце отремонтированы предоставить 5′ фосфаты необходимые для перевязки компоновщики, как компоновщик сами ООН фосфорилированных. Для перевязки реакции (и NFC реакции) добавить следующее: 25 мкл Taq 2 X Главный микс (способных Ник перевода), 2,5 мкл грунтовка компоновщик-Minus450-F (10 мкм, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 2,5 мкл грунтовка компоновщик-Plus275-R (10 мкм, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC) и 6 мкл H2O. Включите элемент без шаблон (NTC). Инкубировать реакции на Термоциклер с использованием следующих условий: 1 цикл (Ник перевод): 72 ° C для 20 минут, 1 цикл: 95 ° C за 5 мин., 3-4 циклов: 95 ° C 15 s, 58 ° C 15 s, 72 ° C для 30 s, 1 цикл: 72 ° C за 5 мин. Выполните реакции очистки с помощью твердой фазы реверсивные иммобилизации бусы с образцом шарик соотношение 1:1. Элюировать в 40 мкл H2O. Дальнейшего усиления нужный фрагмент (5′ компоновщика + MNase фрагмент + 3 ‘ компоновщика) с помощью соответствующих ПЦР реактивы и следующих грунтовок: Используйте 12,5 мкл мастер смеси ПЦР, 1,25 мкл грунтовка компоновщик-Minus450-F (10 мкм, GGGCAAGTTTGTGGAATTGG), 1,25 мкл грунтовка компоновщик-Plus275-R (10 мкм, AAGTGGATCTCTGCTGTCCC), 2,5 мкл очищенный Ник перевод продукта из шага 6.4. и 7,5 мкл H2O. использование следующих условий: 1 цикл: 98 ° C за 30 сек, 10-16 циклов: 98 ° C 10 s, 63 ° C 10 s, 72 ° C для 15 s, 1 цикл: 72 ° C для 10 мин.Примечание: В случае необходимости, несколько реакции может быть создан параллельно чтобы убедиться, что есть достаточно продукт PCR для последующих шагов. Чтобы визуализировать небольшое количество продукта ПЦР на геле агарозы, настроить дополнительные реакции как шаг 6.5 и увеличить число цикла от 15 до 32. Эта реакция может использоваться как контроль качества, если ампликонов не видно после 15 циклов. Включить также не шаблон элемента (NTC). 7. размер выделения Примечание: Этот шаг отделяет MNase фрагменты с компоновщик правильно прилагаемый 5′ и 3′ от фрагментов с двумя 5′ или два 3’ линкеры на основе размера. Объединить все 15-цикла ПЦР-реакции от шага 6.5., добавить ДНК загрузки красителя и на 0,8% агарозном геле. Акцизный видные группы в 869 bp и очистить ДНК, используя набор для извлечения геля. Подсчитать количество ДНК (например используя спектрофотометр). 8. клонирование PCR-усиливается фрагментов в gRNA вектора выражения Ассамблеей Гибсон Подготовка Ассамблеи мастер смесь следующим образом:Примечание: Следующие шаги адаптированы из Гибсон и др. 12. Создание 6 мл изотермической реакции буфера путем объединения 3 мл 1 М трис (гидроксиметил) aminomethane (Tris)-HCl pH 7.5, 300 мкл 1 M MgCl, 60 мкл deoxyguanosine трифосфат 100 мм (dGTP), 60 мкл 100 мм деоксиаденозин трифосфата (dATP), 60 мкл 100 мм deoxythymidine Аденозинтрифосфат (dTTP), 60 мкл 100 мм Дезоксицитидин трифосфата (дЦТФ), 300 мкл 1 М Дитиотреитол (DTT), 1,5 г полиэтиленгликоля (PEG) -8000, 300 мкл 100 мм Никотинамидадениндинуклеотид (NAD) в сверхчистого H2O.Примечание: Этот буфер может быть aliquoted и хранятся при температуре-20 ° C. Создание 1,2 мл Ассамблеи Мастер микс, объединяя 320 мкл 5 X изотермической реакция буфера, 3 мкл 10 U/мкл T5 exonuclease, 20 мкл 2 U/мкл ДНК-полимеразы, 160 мкл 40 U/мкл ДНК лигаза в сверхчистого H2O. Использование 15 мкл Ассамблея мастер смеси с 5 мкл Вставьте.Примечание: Мастер смесь Ассамблея может быть aliquoted и хранятся при температуре-20 ° C, где он стабилизирован более чем на один год и может мириться несколько циклов замораживания оттаивания. Выбранной количество T5 exonuclease идеально подходит для использования с вылетами. Вектор позвоночника пищеварениеПримечание: Не забудьте дайджест достаточное количество вектора как входные данные для требуемого числа Ассамблея реакций на шаге 8.3. В реакции, добавьте следующее: 1,5 мкг gRNA выражение вектор (pgRNA-pLKO.1), 5 мкл буфера, 1.5 мкл возрастая (5U/мкл) и 38,5 мкл H2O. инкубировать дайджест при 37 ° C на 2 ч. Дефосфорилирование линеаризованного вектора.Примечание: Этот шаг рекомендуется, но не строго необходимо. При exonuclease T5 в мастер смеси будет главным образом удалить возрастсвесы, прежде чем Taq ДНК лигаза имел возможность действовать. Таким образом не ожидается, чрезмерного повторного перешнуровка вектора. 2.5 мкл креветок фермента щелочной фосфатазы (РСПД, 1 U/мкл). Инкубировать при 37 ° C за 30 минут, а затем инактивирует фермент, инкубации при 65 ° C за 5 мин. Выполнение очистки ДНКПримечание: Рекомендуется выполнить шаг извлечения геля агарозы. В качестве альтернативы можно использовать столбец или шарик очистки. Важно проверить, что пищеварение вектор является полным, например, электрофорез геля агарозы. Для сравнения следует параллельно непереваренных вектор. Подсчитать количество очищенной переваривается вектора в образце. Настроить сборку с 2 раза Молярная избыток вставок для векторных. За 20 мкл реакции использования 100 ng вектора (возрастя дайджест из шага 8.5) 12.2 ng вставки (из шага 7.1.), 15 мкл Ассамблея Мастер микс из шага 8.1.2. в H2O. Инкубируйте на 50 ° C за 1 час. Очищайте реакции, с помощью столбца очистки. Ресуспензируйте ДНК в 75 мкл H2O (или соответствующие тома в зависимости от масштаба электропорации).Примечание: Эффективность преобразования во многом зависит от чистоты ДНК. Дополнительная очистка шаги (например извлечение фенола/хлороформ) может повысить эффективность. 9. Подготовка TG1 электро компетентных клеток E. coli Убедитесь, что все центрифуга бутылки и флаконы свободны от моющих средств путем промывки и последующего заполнения с дистиллированной водой перед автоклавированием.Примечание: Этот шаг помогает для удаления любых загрязнений, которые могут повлиять на эффективность преобразования. Вода должны быть отброшены непосредственно перед использованием. Кроме того использование одноразовых центрифугирования бутылок может быть целесообразным. Убедитесь, что бутылки центрифуги, трубок и решения, используемые для приготовления electrocompetent клетки охлажденной на льду до использования. Лучше всего проводить следующие шаги в холодной комнате, чтобы свести к минимуму колебания температуры, которые могут повлиять на эффективность преобразования. Подготовка среднего 2TY. 16 g bacto Триптон 10 г дрожжей экстракт и 5 г NaCl, добавьте дистиллированной воды 1 Л, смеси и автоклав. Средний хранить при комнатной температуре. Готовят блюда биопроб 2TY-агар покрытием и Петри 10 см, содержащие соответствующий антибиотик. Пластины хранить при 4 ° C.Примечание: Выбор антибиотика зависит от характера gRNA вектора выражения, ампициллин использования 100 мкг/мл для pgRNA-pLKO.1. Очистите от глицерина запас TG1 клеток для инокуляции 10 мл 2TY среды (без антибиотиков). Инкубируйте культуры при 37 ° C ночь (~ 16 h) с встряхивания на 225 об/мин. Прививок 1 Л 2TY среды (без антибиотиков) с 10 мл на ночь культуры (1/100 разрежения) и одинаково разделить его между двух 2 Л флаконы (содержащие перегородок). Инкубируйте культуры при 37 ° C, 225 об/мин до OD600 Нм 0.55 (примерно через 1,5-2 ч). Используйте спектрофотометр регулярно проверять OD600 Нм. Холод культур на льду за 30 мин. Разделение культуры поровну между четырьмя 500 мл бутылки центрифуги (предварительно охлажденным на льду). Центрифуги для 15 мин на 4000 x g при 4 ° C в предварительно охлажденной центрифуге. Декант supernatants и добавить 1 тома (т.е. 250 мл) предварительно охлажденные ледяной стерильной дистиллированной H2O каждому из бутылки центрифуги. Ресуспензируйте бактериальных Пелле закрученного или переворачивать бутылку (или нежный закупорить, если это необходимо).Примечание: Это легче Ресуспензируйте гранулы первого добавлением небольшого количества воды. Убедитесь, что гранулы в конечном итоге полностью высокомобильна. Центрифуги для 15 мин на 4000 x g при 4 ° C. Повторите мыть два раза (шаги 9.12. и 9,13). Удалите супернатант. Будьте осторожны, когда декантирующие как бактериальный Пелле становится все более свободно после стирки. Ресуспензируйте гранулы в 50 мл стерильного, ледяной 10% глицерина и перенести его на предварительно охлажденные 50 мл пластиковых пробирок. Центрифуга клетки для 15 минут ~ 4000 x g при 4 ° C. Осторожно удалите супернатант. Нежно ресуспензируйте бактерий в 2 мл ледяной стерильные 10% глицерина. Держите на льду, если клетки должны использоваться сразу же для электропорации.Примечание: Клетки могут быть заморожены в аликвоты 50 мкл в 0,5 мл трубки в ванне с сухим льдом этанола и хранятся при температуре-80 ° C, но это не рекомендуется. 10. электропорации TG1 клеток кишечной палочки Electrocompetent Примечание: Электропорация является одним из узких мест в поколение всеобъемлющая библиотека. Чтобы сохранить в представлении библиотеки, рекомендуется проводить столько индивидуальных электропорации реакции/сроки необходимые и выполните описанные ниже шаги контроля качества (10.6. и 10.8.). Аликвота очищенный реакций (из шага 8.8) в стерильных и предварительно охлажденные ПЦР пробирок и держать их на льду (1 мкл на трубу). Холод 1 мм зазор электропорации кюветы на льду. 25 мкл свежеприготовленные TG1 клеток непосредственно к одной Алиготе ДНК и немедленно перевести смесь в кювет электропорации. Флик или коснитесь кювета для обеспечения клеток/ДНК смесь распределяется по длине кювет камеры (без воздуха или пузырьки). Поместите кювету в камере слайд и запустите программу, соответствующую электропорации (например 1 импульса 1,8 кв (EC1)).Примечание: Постоянная времени должно лежать между 5.7 и 6,0 г-жа в случае electroporator дуги, Флик кювета, убедитесь, что нет пузырьков воздуха в камере и повторите попытку. Сразу же мкл 975 комнатной температуре 2TY среды в кювет. С помощью пипетки передачи, переместите electroporated бактерий в 50 мл трубки. Повторите шаг 10.2. и собрать все клетки превращается с одной библиотекой в один тюбик 50 мл. Документ общий объем. Этап контроля качества Для количественного определения компетенции недавно созданного электро компетентных клеток, выполните отдельный электропорации реакции, используя определенное количество режиссерский плазмидной ДНК (например 10 pg pUC19 управления плазмида). Передаете это 1,5 мл отцентрифугировать.Примечание: Компетенция должна быть по крайней мере 1010 колонии формирование единиц (cfu) в мкг ДНК. Свежеприготовленные клетки обычно работают лучше, чем это. Инкубируйте преобразованные бактерий при 37 ° C 60 мин, тряски на 225 об/мин. Этап контроля качества: Плиты определено небольшое количество бактерий, преобразована с библиотекой (например 10 мкл 10-100 раз разрежения) на табличке агар 10 см с соответствующим антибиотиком выбора.Примечание: Зная объем общей культуры (из шага 10.6.), полученные колонии номер может использоваться для оценки общее количество колоний для всей библиотеки. 20-30 раз представление библиотеки в идеале должна быть сохранена. Разогнать оставшуюся часть бактерий на 2TY агар покрытием биопроб блюда, содержащие соответствующий выбор антибиотика.Примечание: Объем культуры может быть уменьшена центрифугирования в ~ 4000 x g 10 мин (или пока не сформировалась видны гранулы и супернатант появляется ясно). Это уменьшает время, необходимое пластины для просушки после распространения культуры. Использование плит, а не жидкой культуры минимизирует несоразмерного роста отдельных колоний. 13 Распространять соответствующий объем pUC19 управления электропорации реакции на дополнительные 10 см блюдо агар с соответствующим антибиотиком выбора. Инкубировать плиты агара на ночь (16 ч) при температуре 37 ° C. Количество полученных колоний на тарелках управления (pUC19 и управления Библиотека пластина) для оценки CFU/мкг ДНК для бактерий а также библиотека сложности. 11. Добыча плазмидной ДНК Добавить 10 мл 2-ты СМИ на ночь тарелки, скрести бактериальных слой от пластину, используя одноразовые разбрасыватель и собирают его в 50 мл трубки. Повторите несколько раз до тех пор, пока все пластины кажется чистой. Извлечь ДНК плазмиды макси комплект (2-3 колонки необходимо в био пробирного пластины).