Regenerering av klädd guld mikroelektroder utrustade för en realtid Cell Analyzer
Summary
Det här protokollet beskriver en allmän strategi för att regenerera kommersiella klädd guld mikroelektroder utrustade för en etikett-fri cell analyzer syftar till att spara på de höga löpande kostnader ofmicrochip-baserade analyserna. Regenereringsprocessen inkluderar trypsin matsmältningen, sköljning med etanol och vatten, och en snurrande steg, vilket gör att upprepad användning av mikrochips.
Abstract
Etikett-fri cell-baserad analysen är fördelaktiga för biokemiska studien på grund av det inte kräver användning av försöksdjur. På grund av dess förmåga att ge mer dynamisk information om celler under fysiologiska betingelser än klassiskt biokemiska analyser, denna etikett-gratis realtid cell analys bygger på elektrisk impedans principen är att locka mer uppmärksamhet under senaste årtiondet. Dess praktiska användning kan dock begränsas på grund av den relativt dyra kostnaden för mätning, där kostsamma förbrukningsbart disponibla guld mikrochips används för cellen analysatorn. I detta protokoll, har vi utvecklat en allmän strategi för att regenerera klädd guld mikroelektroder utrustade för en kommersiell etikett-fri cell analyzer. Regenereringsprocessen inkluderar trypsin matsmältningen, sköljning med etanol och vatten, och en snurrande steg. Den föreslagna metoden har testats och visat sig vara effektivt för regenerering och upprepad användning av kommersiella elektroniska plattor minst tre gånger, vilket hjälper forskare Spara på hög löpande kostnaden för realtid cell analyser.
Introduction
På grund av dess effektiva och mindre arbetsintensiva experimentell process, har etikett-fri cell-baserad teknik upplevt snabb tillväxt under det senaste årtiondet för analytisk samt screening ändamål såsom i aspekten av proteomik1,2 , drog leverans3, etc.4,5 jämfört med traditionella biokemiska metoder syftar till att cellen analys, etikett-gratis realtid cell assay med prototypen utvecklats av Giaever och medarbetare tidigare6 är baserad på principen om inspelning av elektrisk signalförändringar på ytan av cell-anslutna mikrochips, som möjliggör en kontinuerlig mätning av celltillväxt eller migration på ett kvantitativt sätt. Efter denna strategi, en realtid cell elektronisk avkänning (RT-CES) system med elektrisk impedans-baserad detektion principen var introducerade7,8 och mer nyligen en kommersiell realtid cell analyzer (RTCA) lanserades för laboratorium forskning9.
Den kommersiella realtid cell analyzer läser främst cellernas evoked signaler om elektrisk impedans, vilket resultera från de fysiologiska förändringarna av ruvade celler inklusive cellproliferation, migration, livskraft, morfologi och följsamhet på den ytan av mikrochips10,11. Sådana elektriska signaler omvandlas vidare i Analyzer till en dimensionslös parameter som heter Cell Index (CI) att bedöma cell status. Ändringen av impedansen av mikrochips speglar främst Joniska närmiljön täckta celler på gränssnittet elektrod/lösning. Därför är den analytiska prestandan av cell analyzer starkt beroende av enheten core fjärranalys, den disponibla mikrochips (dvs, så kallade elektroniska plattor, t.ex., 96/16/8-brunn), som består av klädd guld mikroelektroder lithographically skrivs ut längst ned på inkubation brunnar. De guld mikroelektroder montera i en cirkel-on-line-format (figur 1) och täcker större delen av ytan av inkubering brunnar, som möjliggör dynamisk och känslig detektion av kopplade celler3,12,13 ,14. CI kommer att öka när det gäller mer yttäckning av celler på chip, och minskar när celler utsätts för en för människor som leder till apoptos. Även i realtid cell analyzer har ofta använts för att fastställa cytotoxicitet11 och neurotoxicitet15 och ger mer kinetic information än klassiskt slutpunkter metod, är de elektroniska engångstallrikar den mest kostsamma förbrukningsmaterial.
Det har hittills inga tillgängliga metoder för regenerering av elektroniska plattan, vilket förmodligen beror på att hårda regenerering villkor, såsom piranha lösning eller ättiksyra är inblandade16,17, 18, som kan förändra elektriska status av guld mikrochips. En mild och effektiv metod att ta bort de vidhäftande cellerna och andra ämnen från ytan av gold chips kommer därför önskvärt för elektronisk platta regenereringsprocessen. Vi har nyligen utvecklat ett protokoll som syftar till förnyelse av elektroniska engångstallrikar med icke-korrosiva reagens och regenererad marker präglades av elektrokemiska samt optiska metoder19. Med hjälp av lättillgängliga och måttlig laboratoriereagenser inklusive trypsin och etanol, har vi etablerat en allmän metod för att återskapa den kommersiella elektroniska plattan utan biverkningar, som har tillämpats korrekt för att regenerera de två huvudtyperna av elektronisk platta (både 16 och L8) används för RTCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi sammanfattat flera tillgängliga metoder17,23,24,25,26 för regenerering mikrochips i tabell 1. I grund och botten, dessa metoder inblandade relativt hårda experimentella förhållanden att uppnå fullständig regenerering av chips på grund av förekomsten av starka molekyl-molekyl interaktioner såsom immun anläggningen används för SP…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet stöddes av National Natural Science Foundation Kina (U1703118), ett projekt finansierat av prioriterade akademiska Program utveckling av Jiangsu högre utbildning institutioner (PAPD), Jiangsu Shuangchuang Program, öppna medel av nyckeln staten Laboratoriet för cellgifter/Biosensing och kemometri (2016015) och det nationella laboratoriet för biomakromolekyler (2017kf05) och Jiangsu Specially-Appointed Professor projektet, Kina.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Referencias
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
