Regeneración de microelectrodos de oro vestidas para un analizador en tiempo real de la célula
Summary
Este protocolo describe una estrategia general para regenerar comerciales microelectrodos de oro vestidas para un analizador de célula libre de etiqueta para ahorro en los alta ejecución costos ofmicrochip-ensayos. El proceso de regeneración incluye la digestión de la tripsina, enjuague con agua y etanol y un paso de giro, que permite el uso repetido de los microchips.
Abstract
El ensayo de celular libre de etiqueta es ventajoso para estudio bioquímico, debido a no requiere el uso de animales de experimentación. Debido a su capacidad para proporcionar información dinámica sobre células bajo condiciones fisiológicas que ensayos bioquímicos clásicos, este ensayo de célula libre de etiquetas en tiempo real basado en el principio de impedancia eléctrica está atrayendo más atención durante los últimos década. Sin embargo, su utilización práctica puede ser limitado debido al costo relativamente caro de medición, en el que se utilizan microchips oro desechables consumibles costosos para el analizador de células. En este protocolo, hemos desarrollado una estrategia general para regenerar microelectrodos de oro vestidas para un analizador de célula libre de etiqueta comercial. El proceso de regeneración incluye la digestión de la tripsina, enjuague con agua y etanol y un paso de spinning. El método propuesto ha sido probado y demostrado para ser eficaz para la regeneración y el uso repetido de las placas electrónicas comerciales de al menos tres veces, que ayudará a los investigadores excepto en el alto costo de ejecución de ensayos en tiempo real de la célula.
Introduction
Debido a su eficiente y menos dependiente de trabajo proceso experimental, etiqueta-libre celular basada en tecnología ha sido testigo de un crecimiento rápido durante la última década fines analíticos como screening como en el aspecto de proteómica1,2 , entrega3, etc.4,5 comparada con métodos bioquímicos tradicionales dirigidos al análisis de la célula, análisis de la célula libre de etiquetas en tiempo real con el prototipo desarrollado por Giaever y compañeros de trabajo previamente6 la droga se basa en el principio de registro de los cambios de la señal eléctrica en la superficie de los microchips conectados a celulares, que permiten una medición continua del crecimiento de la célula o la migración de forma cuantitativa. Siguiendo esta estrategia, se lanzó un celular en tiempo real electrónico detección sistema (RT-CES) utilizando el principio de detección basado en la impedancia eléctrica fue introducido7,8 y más recientemente un analizador comercial celular en tiempo real (RTCA) laboratorio de investigación9.
El analizador celular en tiempo real comercial principalmente Lee señales evocadas de las células de impedancia eléctrica, que resultan de los cambios fisiológicos de células incubados incluyendo proliferación celular, migración, viabilidad, morfología y la adherencia en la superficie de microchips10,11. Estas señales eléctricas se convierten más lejos por el analizador en un parámetro adimensional, denominado la célula índice (CI) para evaluar el estado de la célula. El cambio de la impedancia de los microchips refleja principalmente el entorno iónico de las células de la cubierta en la interfase electrodo/disolución. Por lo tanto, el rendimiento analítico del analizador celular depende en gran medida la unidad detección de núcleo, los microchips disponibles (es decir, llamadas placas electrónicas, por ejemplo, 96/16/8-bien), que se hacen de microelectrodos de oro vestidas litográfico impreso en la parte inferior de los pozos de incubación. Los microelectrodos oro montan en forma de círculo en la línea (figura 1) y cubren la mayor parte de la superficie de los pozos de incubación, que permiten la detección dinámica y sensible de células adjunto3,12,13 ,14. El CI aumentará en el caso de más cobertura de superficie de las células en el chip y disminuye cuando las células se exponen a una sustancia tóxica que resulta en la apoptosis. Aunque el analizador en tiempo real de la célula se ha utilizado con frecuencia para determinar la citotoxicidad11 y neurotoxicidad15 y proporcionar más información cinética que el método clásico de extremos, las placas electrónicas desechables son los más consumibles.
Hasta ahora, ha habido no hay métodos disponibles para la regeneración de la placa electrónica, que es probablemente debido a que las condiciones de regeneración áspero, como solución de Piraña o ácido acético son implicados16,17, 18, que puede alterar el estado eléctrico de los microchips de oro. Por lo tanto, un método suave y eficaz para eliminar las células adherentes y otras sustancias de la superficie de oro fichas será conveniente para el proceso de regeneración de la placa electrónica. Recientemente hemos desarrollado un protocolo para la regeneración de platos electrónicos desechables reactivos corrosivos y las virutas regeneradas fueron caracterizadas por métodos electroquímicos y ópticos19. Mediante el uso de reactivos de laboratorio fácilmente disponibles y moderada como tripsina y etanol, hemos establecido un método general para regenerar la placa electrónica comercial sin efectos adversos, que se aplica con éxito para regenerar los dos tipos principales de la placa electrónica (16 y L8) utilizan para la RTCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resumimos varios métodos disponibles17,23,24,25,26 para regenerar microchips en la tabla 1. Básicamente, estos métodos involucrados condiciones experimentales relativamente fuertes para lograr la regeneración completa de fichas debido a la presencia de interacciones fuertes de molécula-molécula como la del complejo inmune utilizado para …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por nacional Ciencias naturales Fundación de China (U1703118), un proyecto financiado por la prioridad académica programa de desarrollo de Jiangsu educación superior instituciones (DPPA), Jiangsu Shuangchuang programa, fondos abiertos de la clave del estado Laboratorio de quimioterapia/biodetección y Quimiometría (2016015) y el laboratorio nacional de biomacromoléculas (2017kf05) y profesor de Jiangsu Specially-Appointed proyecto, China.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Referencias
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
