Regenerering av plassert gull Microelectrodes utstyrt for en sanntid celle Analyzer
Summary
Denne protokollen beskriver en generell strategi for å regenerere kommersielle plassert gull microelectrodes utstyrt for en etikett-fri celle analysator å spare på høy løpende kostnader ofmicrochip-baserte analyser. Gjenfødelse prosessen inkluderer trypsin fordøyelsen, skylling med etanol og vann og en spinnende trinn, som gjør at gjentatt bruk av microchips.
Abstract
Etikett-fri cellebasert analysen er fordelaktig for biokjemiske studien fordi det ikke krever bruk av forsøksdyr. På grunn av sin evne til å gi mer dynamisk informasjon om cellene under fysiologiske forhold enn klassisk biokjemiske analyser, tiltrekker denne etiketten-gratis sanntid celle analysen basert på elektrisk impedans mer oppmerksomhet i løpet av siste tiår. Dens praktisk utnyttelse kan imidlertid være begrenset på grunn av relativt dyre kostnadene for måling, der dyre forbruksvarer disponible gull microchips brukes for den celle analysatoren. I denne protokollen, har vi utviklet en generelle strategi for å regenerere plassert gull microelectrodes utstyrt for en kommersiell etikett-fri celle analysator. Trypsin fordøyelsen, skylling med etanol og vann og en spinnende trinn omfatter prosessen med gjenfødelse. Den foreslåtte metoden er testet og vist seg å være effektive for regenerasjon og gjentatt bruk av kommersielle elektronisk plater minst tre ganger, som vil hjelpe forskere lagre på den høye kjørende kostnaden på sanntid celle analyser.
Introduction
På grunn av sin effektive og mindre arbeidskrevende eksperimentelle prosessen, etikett-fri cellen-basert teknologi har vært vitne til rask vekst det siste tiåret for analytisk samt sortering formål som i aspektet av Proteomikk1,2 , stoffet levering3, etc.4,5 forhold med tradisjonelle biokjemiske metoder rettet mot celle analyse, etikett-gratis sanntid celle analysen med prototypen utviklet av Giaever og kolleger tidligere6 er basert på prinsippet om innspillingen elektrisk signal endringer på overflaten av celle-vedlagt microchips, som tillater en kontinuerlig måling av cellevekst eller migrering i en kvantitativ måte. Etter denne strategien, en sanntids celle elektronisk sensing (RT-CES) systemet bruker elektrisk impedans-basert oppdagelsen prinsippet var introdusert7,8 , og mer nylig en kommersiell sanntid celle analyzer (RTCA) ble lansert for laboratorium forskning9.
De kommersielle sanntid celle analyserer hovedsakelig leser ut cellene vakte signaler av elektrisk impedans, som følge av fysiologiske endringer inkubert celleområde inkludert celle spredning, migrasjon, levedyktighet, morfologi og etterlevelse på den overflaten av microchips10,11. Slike elektriske signaler konverteres ytterligere av analyseringen til en dimensjonsløs parameter kalt celle indeks (CI) å vurdere celle status. Endring av impedans på microchips gjenspeiler hovedsakelig ioniske lokalmiljøet dekket celler på elektroden/løsning grensesnittet. Derfor stoler analytisk ytelsen av cellen analysator tungt på kjernen sensing enheten, de disponible microchips (dvs., såkalte elektronisk plater, f.eks, 96/16/8-vel), som er laget av plassert gull microelectrodes lithographically skrives ut nederst på inkubasjon brønner. De gull microelectrodes sammen i en sirkel-on-line format (figur 1) og dekker det meste av arealet av inkubering, som tillater dynamisk og følsom deteksjon av tilknyttede celler3,12,13 ,14. CI vil øke hvis flere dekning av celler på chip, og redusere når celler er utsatt for et toxicant som resulterer i apoptose. Selv om sanntid celle analysatoren er ofte brukt til å bestemme cytotoksisitet11 og nevrotoksisitet15 og gi kinetic mer enn klassisk endepunktene metoden, er disponibel elektronisk platene det costliest Forbruksvare.
Til nå, har det ikke vært noen metoder for fornyelse av den elektroniske platen, som er trolig på grunn av at harde gjenfødelse forhold, som piranha løsning eller eddiksyre er involvert16,17, 18, som kan endre elektrisk status for gull microchips. En mild og effektiv metode for å fjerne tilhenger cellene og andre stoffer fra overflaten av gull chips vil derfor være ønskelig for elektronisk plate gjenfødelse prosessen. Vi har nylig utviklet en protokoll rettet mot fornyelse av disponibel elektronisk plater ved hjelp av ikke-korroderende reagenser og gjenskapte chips var preget av elektrokjemiske samt optiske metoder19. Ved hjelp av lett tilgjengelige og moderat laboratorium reagenser inkludert trypsin og etanol, har vi etablert en generell metode for å regenerere den kommersielle elektroniske platen uten bivirkninger, som er brukt til å regenerere de to hovedtypene elektronisk plate (16 og L8) brukes for RTCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi oppsummert flere tilgjengelige metodene17,23,24,25,26 for regenererende microchips i tabell 1. Innerst inne, disse metodene involvert relativt hardt eksperimentelle forhold å oppnå hele fornyelse av chips på grunn av sterk molekyl-molekylet interaksjoner som immun komplekset brukes for SPR sjetonger. Disse harde eksperimentelle forhold k…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (U1703118), et prosjekt finansiert av prioritet faglig Program utvikling av Jiangsu høyere utdanning institusjoner (PAPD), Jiangsu Shuangchuang programmet, åpne midler av nøkkelen tilstand Laboratorium for kjemoterapi/Biosensing og kjemometri (2016015) og National Laboratory av Biomacromolecules (2017kf05) og Jiangsu Specially-Appointed Professor prosjektet, Kina.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Referencias
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
