सरणी गोल्ड Microelectrodes के पुनर्जनन एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक के लिए सुसज्जित
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक सामांय रणनीति के लिए एक लेबल मुक्त सेल विश्लेषक उच्च चल लागत ofmicrochip-परख के आधार पर बचत के उद्देश्य से वाणिज्यिक सरणी सोने microelectrodes पुनर्जीवित पुनर्जंम के लिए । पुनर्जनन प्रक्रिया trypsin पाचन शामिल है, इथेनॉल और पानी के साथ धोने, और एक कताई कदम है, जो माइक्रोचिप्स के उपयोग के दोहराया सक्षम बनाता है ।
Abstract
लेबल मुक्त सेल आधारित परख क्योंकि यह प्रयोगात्मक पशुओं के उपयोग की आवश्यकता नहीं है जैव रासायनिक अध्ययन के लिए लाभप्रद है । अपने को शास्त्रीय जैव रासायनिक परख से शारीरिक स्थितियों के तहत कोशिकाओं के बारे में अधिक गतिशील जानकारी प्रदान करने की क्षमता के कारण, इस लेबल मुक्त वास्तविक समय सेल विद्युत प्रतिबाधा सिद्धांत पर आधारित परख अतीत के दौरान अधिक ध्यान आकर्षित कर रहा है दशक. हालांकि, इसकी व्यावहारिक उपयोग माप की अपेक्षाकृत महंगी लागत, जिसमें महंगा उपभोज्य डिस्पोजेबल सोने माइक्रोचिप्स सेल विश्लेषक के लिए उपयोग किया जाता है के कारण सीमित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक सामांय रणनीति विकसित की है एक वाणिज्यिक लेबल मुक्त सेल विश्लेषक के लिए सुसज्जित सरणी सोने microelectrodes पुनर्जंम । पुनर्जनन प्रक्रिया trypsin पाचन, इथेनॉल और पानी के साथ धोने, और एक कताई कदम भी शामिल है । प्रस्तावित विधि का परीक्षण किया गया है और वाणिज्यिक इलेक्ट्रॉनिक प्लेटों के पुनर्जनन और दोहराया उपयोग के लिए प्रभावी होने के लिए दिखाया गया है, जो मदद करेगा शोधकर्ताओं ने वास्तविक समय सेल परख के उच्च चल लागत पर बचाने के लिए कम से तीन बार ।
Introduction
अपने कुशल और कम श्रम गहन प्रयोगात्मक प्रक्रिया के कारण, लेबल मुक्त सेल आधारित प्रौद्योगिकी विश्लेषणात्मक के लिए पिछले एक दशक में तेजी से वृद्धि देखी गई है और साथ ही स्क्रीनिंग प्रयोजनों प्रोटियोमिक्1के पहलू में के रूप में,2 , दवा वितरण3, आदि4,5 परंपरागत जैव रासायनिक सेल विश्लेषण के उद्देश्य से तरीकों के साथ तुलना में, लेबल से मुक्त वास्तविक समय सेल परख प्रोटोटाइप के साथ Giaever और सहकर्मियों द्वारा विकसित पहले6 सेल की सतह पर बिजली के संकेत परिवर्तन-संलग्न माइक्रोचिप्स, जो एक मात्रात्मक तरीके से सेल विकास या प्रवास के एक सतत माप की अनुमति रिकॉर्डिंग के सिद्धांत पर आधारित है । इस रणनीति के बाद, एक वास्तविक समय सेल इलेक्ट्रॉनिक सेंसिंग (आरटी-CES) प्रणाली का उपयोग कर विद्युत प्रतिबाधा आधारित पता लगाने के सिद्धांत7,8 और अधिक हाल ही में एक वाणिज्यिक रीयल-टाइम सेल विश्लेषक (RTCA) शुरू किया गया था प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए9.
वाणिज्यिक रीयल-टाइम सेल विश्लेषक मुख्य रूप से बिजली प्रतिबाधा, जो सेल प्रसार, प्रवास, व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान, और पालन सहित मशीनी कोशिकाओं के शारीरिक परिवर्तन से परिणाम के ‘ कोशिकाओं पैदा संकेतों बाहर पढ़ता है माइक्रोचिप्स की सतह10,11. इस तरह के बिजली के संकेतों को आगे एक क्वांटिटी पैरामीटर सेल सूचकांक (CI) नाम में सेल स्थिति का आकलन करने के लिए विश्लेषक द्वारा परिवर्तित कर रहे हैं । माइक्रोचिप्स के प्रतिबाधा के परिवर्तन मुख्य रूप से इलेक्ट्रोड पर कवर कोशिकाओं के स्थानीय ईओण वातावरण को दर्शाता है/समाधान इंटरफ़ेस. इसलिए, सेल विश्लेषक के विश्लेषणात्मक प्रदर्शन कोर संवेदन इकाई पर भारी निर्भर करता है, डिस्पोजेबल माइक्रोचिप्स (यानी, तथाकथित इलेक्ट्रॉनिक प्लेटें, उदा, 96/16/8-ठीक है), जो सरणी सोने microelectrodes के बने होते है lithographically मशीन कुओं के नीचे मुद्रित । सोने की microelectrodes एक सर्कल में इकट्ठा-ऑन लाइन प्रारूप (चित्रा 1) और मशीन कुओं की सतह क्षेत्र के सबसे कवर, जो संलग्न कोशिकाओं के गतिशील और संवेदनशील पता लगाने के लिए अनुमति3,12,13 ,14. CI चिप पर कोशिकाओं के अधिक सतह कवरेज के मामले में वृद्धि होगी, और कम जब कोशिकाओं को एक विषैले apoptosis में जिसके परिणामस्वरूप के संपर्क में हैं । हालांकि वास्तविक समय सेल विश्लेषक अक्सर cytotoxicity11 और neurotoxicity15 निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और शास्त्रीय समापन विधि से अधिक काइनेटिक जानकारी प्रदान करते हैं, डिस्पोजेबल इलेक्ट्रॉनिक प्लेटें महंगा कर रहे हैं उपभोज्य.
अब तक, इलेक्ट्रॉनिक प्लेट, जो शायद इस तथ्य के कारण है कि कठोर पुनर्जनन की स्थिति, जैसे पिरांहा समाधान या एसिटिक एसिड16,17शामिल है के उत्थान के लिए कोई उपलब्ध तरीकों गया है, 18, जो सोने की माइक्रोचिप्स की बिजली की स्थिति को बदल सकता है । इसलिए, एक हल्के और कुशल विधि सोने के चिप्स की सतह से अनुयाई कोशिकाओं और अंय पदार्थों को दूर करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक प्लेट पुनर्जनन प्रक्रिया के लिए वांछनीय होगा । हम हाल ही में एक डिस्पोजेबल इलेक्ट्रॉनिक प्लेटें गैर संक्षारक एजेंट और पुनर्जीवित चिप्स का उपयोग कर के पुनर्जनन के उद्देश्य से एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया है विद्युत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऑप्टिकल तरीकों के रूप में19विशेषता । trypsin और इथेनॉल सहित आसानी से उपलब्ध है और उदारवादी प्रयोगशाला एजेंट का उपयोग करके, हम एक सामान्य विधि प्रतिकूल प्रभाव के बिना वाणिज्यिक इलेक्ट्रॉनिक प्लेट पुनर्जीवित करने के लिए स्थापित किया है, जो सफलतापूर्वक दो मुख्य प्रकार पुनर्जीवित करने के लिए लागू होता है इलेक्ट्रॉनिक प्लेट (दोनों 16 और L8) RTCA के लिए इस्तेमाल किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम कई उपलब्ध विधियों संक्षेप17,23,24,25,26 के लिए तालिका 1में माइक्रोचिप्स reचूकने के लिए । मूलतः, इन तरीकों में शामिल अपेक्षाकृत कठोर प्रयोग…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (U1703118) द्वारा समर्थित किया गया था, जो कि Jiangsu उच्चतर शिक्षा संस्थानों (PAPD), Jiangsu Shuangchuang प्रोग्राम, राज्य कुंजी की खुली निधियों के प्राथमिकता वाले अकादमिक कार्यक्रम विकास द्वारा वित्तपोषित परियोजना Chemo/संवेदन और Chemometrics (२०१६०१५) और Biomacromolecules (2017kf05) और Jiangsu विशेष रूप से नियुक्त प्रोफेसर परियोजना, चीन की राष्ट्रीय प्रयोगशाला के लिए प्रयोगशाला ।
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
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