Regeneration der angeordneten Gold Mikroelektroden ausgestattet für eine Echtzeit-Zelle-Analyzer
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine allgemeine Strategie zur kommerziellen angeordneten gold Mikroelektroden ausgestattet für ein Label-freie Zelle Analyzer zur Einsparung auf die hohen laufenden Kosten Ofmicrochip basierende Assays zu regenerieren. Der Regenerationsprozess enthält Trypsin-Verdauung, Spülen mit Wasser, Ethanol und eine Spinnerei Schritt, der wiederholte Verwendung von Mikrochips ermöglicht.
Abstract
Markierungsfreie zellbasierte Assays ist vorteilhaft, biochemische Untersuchung wegen der Verwendung von Versuchstieren nicht erforderlich ist. Aufgrund seiner Fähigkeit, dynamischer Auskunft über Zellen unter physiologischen Bedingungen als klassischen biochemischen Assays zieht dieser markierungsfreie Echtzeit-Zelle-Assay basiert auf dem Prinzip der elektrischen Impedanz mehr Aufmerksamkeit in den letzten zehn Jahre. Seine praktische Nutzung kann aufgrund der relativ teuren Kosten für Messung, begrenzt jedoch in denen teure Verbrauchsmaterialien Einweg gold Mikrochips für die Zelle-Analyzer verwendet werden. In diesem Protokoll entwickelten wir eine allgemeine Strategie zur angeordneten gold Mikroelektroden ausgestattet für einen kommerziellen markierungsfreie Zelle Analyzer zu regenerieren. Der Regenerationsprozess enthält Trypsin-Verdauung, Spülen mit Wasser, Ethanol und eine Spinnerei Schritt. Die vorgeschlagene Methode wurde getestet und gezeigt, dass effektiv für die Regeneration und die wiederholte Verwendung der kommerziellen elektronischen Platten mindestens drei Mal die Forscher speichern auf die hohen laufenden Kosten für Echtzeit-Zelle-Assays helfen.
Introduction
Dank seiner effizienten und weniger arbeitsintensiv experimentellen Prozess erlebte markierungsfreie zellbasierte Technologie rasante Wachstum im letzten Jahrzehnt für analytische sowie Screening Zwecke wie z. B. unter dem Aspekt der Proteomik1,2 , Drogen-Lieferung3, usw.4,5 im Vergleich mit traditionellen biochemischen Methoden zur Zellanalyse, markierungsfreie Echtzeit-Zelle Assay mit zuvor von Giaever und Kollegen entwickelten Prototyp6 basiert auf dem Prinzip der Erfassung elektrisches Signal Veränderungen auf der Oberfläche der Zelle angebracht Mikrochips, die eine kontinuierliche Messung des Zellwachstum oder Migration in einer quantitativen Weise ermöglichen. Nach dieser Strategie wurde eine Echtzeit-Zelle elektronische Sensorik (RT-CES) System elektrische Impedanz-basierte Erkennung Prinzip eingeführt7,8 und seit kurzem auch einen kommerziellen Echtzeit-Zelle-Analyzer (RTCA) wurde gestartet. für Labor Forschung9.
Der kommerzielle Echtzeit-Zelle-Analyzer liest vor allem die Zellen evozierten Signale der elektrischen Impedanz, die sich aus der physiologischen Veränderungen der inkubierten Zellen einschließlich Zellproliferation, Migration, Rentabilität, Morphologie und Termintreue auf die Oberfläche des Mikrochips10,11. Solche elektrischen Signale weiter vom Analyzer eine dimensionslose Parameter mit dem Namen der Zelle Index (CI) zur Beurteilung des Zustands der Zelle umgerechnet. Die Änderung der Impedanz von Mikrochips spiegelt vor allem die ionische Umgebung bedeckten Zellen an der Elektrode/Lösung-Schnittstelle. Daher stützt sich die analytische Leistung von der Zelle Analyzer auf Fernerkundung Kerneinheit Einweg-Mikrochips (d.h., sogenannten elektronischen Platten, z.B., 96/16/8-Brunnen), die aus angeordneten gold Mikroelektroden bestehen lithographically am Ende der Inkubationszeit Brunnen gedruckt. Die gold Mikroelektroden versammeln sich in einem Kreis-on-Line-Format (Abbildung 1) und decken den größten Teil der Fläche der Inkubation Brunnen, die eine dynamische und empfindliche Detektion von angeschlossenen Zellen3,12,13 ermöglichen ,14. Die CI wird bei mehr Flächendeckung der Zellen auf dem Chip zu erhöhen und verringern, wenn Zellen eine Apoptose führt Schlüpfzeit ausgesetzt sind. Obwohl der Echtzeit-Zelle-Analyzer bestimmen Zytotoxizität11 und Neurotoxizität15 und mehr kinetische Informationen als klassische Endpunkte Methode häufig verwendet worden ist, sind die elektronischen Einweggeschirr das teuerste Verbrauchsmaterial.
Bis jetzt gab es keine verfügbaren Methoden für die Regeneration der elektronischen Platte, was wahrscheinlich ist, da sind harte Regeneration Zustände, wie Piranha-Lösung oder Essigsäure mit16,17, 18, die den elektrischen Status gold Mikrochips verändern kann. Daher wird eine leichte und effiziente Methode, adhärenten Zellen und andere Substanzen von der Oberfläche des gold-Chips zu entfernen für die elektronische Platte Regenerationsprozess wünschenswert. Vor kurzem haben wir ein Protokoll, die darauf abzielen, die Regeneration der elektronischen Einweggeschirr mit nichtrostenden Reagenzien und die regenerierten Chips zeichneten sich durch elektrochemische sowie optische Methoden19. Mithilfe von leicht verfügbaren und moderate Laborreagenzien einschließlich Trypsin und Ethanol haben wir eingerichtet, eine allgemeine Methode, um die kommerzielle elektronische Platte ohne Nebenwirkungen, regenerieren die erfolgreich angewendet wird, um die beiden wichtigsten Arten zu regenerieren der elektronische Platte (16 und L8) für RTCA verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir für Sie mehrere Methoden17,23,24,25,26 zum Regenerieren von Mikrochips in Tabelle 1zusammengefasst. Diese Methoden beteiligt grundsätzlich relativ harte Versuchsbedingungen, die vollständige Regeneration der Chips wegen der Anwesenheit von starken Molekül-Molekül Interaktionen wie derjenigen der immun Komplex verwendet für SPR-Chips …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (U1703118), ein Priorität akademischen Programm Entwicklung von Jiangsu Hochschulbildung Institutionen (PAPD), Jiangsu Shuangchuang Programm, offene Fonds des Schlüssels Staat finanziertes Projekt unterstützt. Labor für Chemo/Biosensoren und Chemometrie (2016015) und die National Labor Biomakromoleküle (2017kf05) und Jiangsu Specially-Appointed Professor Projekt, China.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
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