Regeneratie van gekleed gouden Microelectrodes uitgerust voor een Real-Time cel Analyzer
Summary
Dit protocol beschrijft een algemene strategie om te regenereren commerciële gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een label-vrije cel analyzer besparing op de hoge lopende kosten ofmicrochip gebaseerde tests gericht. Het regeneratieproces omvat de spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water, en een stap van spinnen, waardoor herhaalde gebruik van microchips.
Abstract
De label-vrije cel-gebaseerde bepaling is voordelig voor biochemische studie vanwege het vereist niet het gebruik van proefdieren. Vanwege haar vermogen om meer dynamische informatie verstrekken over cellen onder fysiologische omstandigheden dan klassieke biochemische tests, dit label-gratis real-time cel assay gebaseerd op het principe van elektrische impedantie is het aantrekken van meer aandacht tijdens het verleden decennium. Echter, het praktische gebruik kan worden beperkt als gevolg van de relatief dure kosten van meting, waarbij kostbare verbruikbare wegwerp gouden microchips worden gebruikt voor de cel analyzer. In dit protocol hebben we een algemene strategie om te regenereren gekleed gouden microelectrodes uitgerust voor een commerciële etiket-vrije cel analyzer. Het regeneratieproces omvat spijsvertering van de trypsine, spoelen met ethanol en water en een spinning-stap. De voorgestelde methode is getest en aangetoond dat het effectief is voor de regeneratie en het herhaalde gebruik van commerciële elektronische platen ten minste driemaal, die onderzoekers opslaan op de hoge lopende kosten van real-time cellen zal helpen.
Introduction
Vanwege haar efficiënte en minder arbeidsintensieve experimentele proces, label-vrije cel-gebaseerde technologie is getuige geweest van snelle groei in het afgelopen decennium voor zowel analytische als screening doeleinden, zoals in het aspect van proteomics1,2 , levering3, etc.4,5 vergeleken met traditionele biochemische methoden gericht op cel analyse, real-time label-vrije cel assay met het prototype ontwikkeld door Giaever en collega’s eerder6 van de drug is gebaseerd op het beginsel van de opname van wijzigingen van het elektrische signaal op het oppervlak van de cel-ingeschrevenen microchips, die het mogelijk een Continumeting van celgroei of migratie op een kwantitatieve manier maken. Naar aanleiding van deze strategie, een real-time cel elektronische sensing (RT-CES) systeem met behulp van elektrische impedantie gebaseerde detectie beginsel werd geïntroduceerde7,8 , en meer recentelijk een commerciële real-time cel analyzer (RTCA) werd gelanceerd voor laboratorium onderzoek9.
De commerciële real-time cel analyzer voornamelijk leest de cellen evoked signalen van elektrische impedantie, die uit de fysiologische veranderingen van bebroede cellen voortvloeien, met inbegrip van celproliferatie, migratie, levensvatbaarheid, morfologie en naleving van de oppervlak van microchips10,11. Deze elektrische signalen worden verder omgezet door de analyzer een dimensieloze parameter met de naam de cel Index (CI) te beoordelen van de status van de cel. De verandering van de impedantie van microchips weerspiegelt voornamelijk de Ionische omgeving van overdekte cellen op het raakvlak van de elektrode/oplossing. Dus, de analytische prestaties van de cel analyzer leunt op de kern sensing eenheid, de wegwerp microchips (d.w.z., zogenaamde elektronische platen, bijvoorbeeld, 96/16/8-well), die zijn vervaardigd van gekleed gouden microelectrodes lithographically onderaan van incubatie putten. De gouden microelectrodes monteren in een cirkel-on-line indeling (Figuur 1) en dekking van de meeste van de oppervlakte van de incubatie putten, waarmee dynamische en gevoelige detectie van gekoppelde cellen3,12,13 ,14. De CI zal vergroten in het geval van meer oppervlakte dekking van cellen op de chip en afnemen wanneer cellen worden blootgesteld aan een veroorzaken als gevolg in apoptosis. Hoewel de real-time cel analyzer vaak gebruikt is om te bepalen van cytotoxiciteit11 en neurotoxiciteit15 en meer kinetische informatie verstrekken dan eindpunten van de klassieke methode, zijn de wegwerp elektronische platen de duurste verbruiksgoederen.
Tot nu toe zijn er geen beschikbare methoden voor de regeneratie van de elektronische plaat, die waarschijnlijk wijten aan het feit dat harde regeneratie aandoeningen, zoals piranha-oplossing of azijnzuur betrokken16,17, zijn 18, die de elektrische status van gouden microchips kunnen veranderen. Een milde en efficiënte methode om te verwijderen van de Adherente cellen en andere stoffen van het oppervlak van goud chips zullen daarom wenselijk voor het regeneratieproces elektronische plaat. Onlangs hebben we een protocol gericht op het herstel van de wegwerp elektronische platen met behulp van niet-corrosieve reagentia en de geregenereerde chips werden gekenmerkt door elektrochemische evenals optische methodes19. Met behulp van gemakkelijk beschikbaar en matige laboratoriumreagentia, met inbegrip van trypsine en ethanol, hebben we een algemene methode om te regenereren de commerciële elektronische plaat zonder bijwerkingen, die goed is toegepast op het regenereren van de twee belangrijkste soorten opgericht van elektronische plaat (16 en L8) gebruikt voor RTCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
We samengevat de verschillende beschikbare methoden17,23,24,25,26 voor het regenereren van microchips in tabel 1. Kortom, deze methoden betrokken relatief harde proefomstandigheden om het volledige herstel van de chips door de aanwezigheid van sterke molecuul-molecuul interacties zoals die van het immuun complex gebruikt voor SPR-chips. Barre …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (U1703118), een project gefinancierd door de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu hogeronderwijs instellingen (PAPD), Jiangsu Shuangchuang programma, Open fondsen van de sleutel staat Laboratorium voor Chemo/Biosensing en Chemometrie (2016015) en het nationale laboratorium van biomacromoleculen (2017kf05) en Jiangsu Specially-Appointed Professor project, China.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
Referencias
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
