Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

Attenzione: se si utilizza S. flexneri come un ceppo destinatario, siete pregati di notare che S. flexneri è un patogeno umano che possa causare malattie gastrointestinali. Gli esperimenti che coinvolgono S. flexneri devono essere eseguiti con biosicurezza adeguate precauzioni (designate BSL-2 in Europa e Stati Uniti d’America o PC2 in Nuova Zelanda). Tutti gli esperimenti condotti in video associato a questo protocollo sono stati fatti utilizzando il ceppo destinatario ben caratterizzato non patogeni di e. coli MG1655 in un ambiente di PC1. Lavoro con Shigella flexneri precedentemente è stato effettuato in un laboratorio BSL-2 presso il Biozentrum a Basilea, come descritto nel 6. Nota: il seguente esperimento è fatto in modo efficace due volte. La prima parte (passo 1.1 – passo 4,5) viene eseguita per trovare la migliore diluizione per placcatura fuori la biblioteca, dove l’obiettivo è quello di trovare una diluizione della coniugazione che dà molte diverse colonie per piastra, ma non così tanti che forma un prato. Si tratta di ridurre la concorrenza tra mutanti con significativamente ridotta fitness e quelli con fitness più robusto. La seconda parte (passaggi 5.1-7,4) è la creazione della biblioteca finale, dove molti piatti sono disseminate della diluizione appropriata della biblioteca. 1. a preparare un giorno prima dell’esperimento inoculare, da un’azione congelate, il ceppo di donatore in 2 mL di brodo LB, Millers ricetta (NaCl a 10 g/L) che contenevano ampicillina a 100 µ g/mL. Il ceppo di donatore utilizzato qui è il ceppo di e. coli BW20767 15 che harboring il plasmide pJA1 11. L’uso di ampicillina mantiene la selezione per il plasmide pJA1. Inoculare, da una singola Colonia o azione congelate, il ceppo destinatario in 2 mL di LB media con un indicatore di resistenza diverso da ampicillina o kanamicina. Il destinatario ceppo usato qui è l’ Escherichia coli " wild-type " ceppo MG1655 17 , 18 con un mutante di resistenza spontanea all’acido nalidixico. È cresciuto a 30 µ g/mL di acido nalidixico. Piastre di agar di 1,5% contenenti brodo di Luria 20 preparare (in piatti di petri di 90 mM, circa 12,5 mL). Piastre di agar carente antibiotico possono depositare a 4 ° C per diversi mesi fino all’uso. Piastre di agar di 1,5% contenenti brodo di Luria 20 preparare (in piatti di petri di 90 mM, circa 12,5 mL) contenente sia l’acido nalidixico 30 µ g/ml e kanamicina a 50 µ g/mL (LBA Nal30 Kan50). Piastre di agar contenente antibiotici possono essere memorizzati al buio a 4 ° C per diversi mesi fino all’uso. Preparare 200 mL di terreno LB sterile. LB media può essere conservato a temperatura ambiente per diversi mesi. Preparare 1 mL di 100mm brodo sterile di IPTG, secondo produttore ' istruzioni s. 2. Accoppiamento o coniugazione batterica centrifuga 1 mL di coltura durante la notte del ceppo donatore per 1 minuto a 14.000 x g a temperatura ambiente. Gettare il terreno di crescita. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere tutti i supporti di crescita contenenti antibiotici. Risospendere il pellet cellulare in 110 µ l di LB (non contenenti antibiotici), concentrando così la cultura. Usando pinze sterili, posizionare un filtro sterile nitrocellulosa (in alternativa un sterile pezzo di carta assorbente può essere utilizzato, vedere materiali elenco) in mezzo di una piastra LBA (non contenenti antibiotici). La targhetta di etichettatura " controllo negativo: donatore ". Utilizzando una pipetta, goccia 50 µ l della cultura donatore concentrato sul filtro. Ripetere i punti 2.1-4 per il ceppo destinatario, etichettatura la piastra " controllo negativo: destinatario. " Per la biblioteca, goccia 50 µ l del donatore (dal punto 2.2) e 50 µ l del ceppo destinatario (dal punto 2.5) su un singolo filtro sterile su una piastra di LBA (queste piastre non devono contenere antibiotici). Questa targhetta di etichettatura " biblioteca. " accoppiamento si verifica perché il donatore e il ricevente sono a stretto contatto fisico sul filtro. Posizionare le piastre di agar che contiene i filtri a 37 ° C per 6 h. 3. Attivazione del trasposone pJA1 di IPTG induzione della Transposase preparare tre fiale conici di 15 mL contenente 2 mL di LB con IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM (cioè, 20 µ l di stock di 100 mM di IPTG). Ciascuna etichetta: controllo del donatore, controllo del destinatario e biblioteca. Rimuovere le piastre dall’incubatrice dopo 6 h di crescita a 37 ° C (dal punto 2.4). Alcuni la crescita batterica deve essere visibile sul filtro. Usando pinze sterili, rimuovere il filtro di carta dal controllo dei donatori e inserirlo nel flaconcino da 15 mL conica contrassegnata come donatore controllo (dal punto 3.1). Fare lo stesso per il controllo del destinatario e la biblioteca. Toccare i tubi per ottenere la carta da filtro sul fondo del flaconcino conico da 15 mL e garantire che esso sia completamente sommersa in lb. Vortex le provette per almeno un minuto in alto per dissociare i batteri del filtro di nitrocellulosa. Il LB dovrebbe diventare torbida con cellule batteriche ( Figura 2). Con perle di vetro sterile o una spatola sterile, piastra 200 µ l della sospensione di batteri agitati con vortex dal controllo dei donatori sulle piastre di LBA Nal30 Kan50 con l’etichetta " controllo del donatore, 200 µ l ". Ripetere il passaggio precedente (3.6) per il controllo destinatario, le piastre di etichettatura " controllo destinatario, 200 µ l ". Ripetere il passaggio precedente (3,7) per la biblioteca, le piastre di etichettatura " biblioteca, 200 µ l ". Effettuare ulteriori diluizioni (cioè, 1:5, diluizioni 01:10 e 1: 100, mediante LB non contenenti antibiotici come diluente) della libreria. Piastra di 200 µ l di libreria non diluito e ulteriori diluizioni su opportunamente etichettato piastre LBA Nal30 Kan50. Incubatore piastre posto in 37 ° C per 18 h. cloni con trasposoni inserita in un gene che causa una grande perdita di idoneità potrebbe richiedere più tempo per crescere e compaiono sulla lastra. Ci dovrebbe essere una varietà di formati di Colonia ( Figura 3). Donatore e destinatario ceppo piastre non dovrebbero avere nessuna colonie su di loro. 4. Scegliere la diluizione appropriata della libreria che deve essere utilizzato per la raccolta finale di mutante determinare una diluizione della biblioteca da 3,9 di passaggio che produce molte colonie di varie dimensioni che sono adeguatamente distanziati. L’obiettivo è quello di ottenere colonie come molti come possibile su una piastra, ma non così tanti che le colonie si fondono uno in altro e si contendono le risorse. Questo numero deve essere di circa 500-2.000 colonie per piastra. Nella Figura 3 è riportato un esempio delle densità di Colonia appropriato su una zolla. Registrare il numero di colonie sulle piastre. Calcolare la frequenza di coniugazione (il numero di conjugants a cellula ricevente). Questo dovrebbe essere nella gamma di 1 x 10 -4 a 1 x 10 -6 19. Determinare il numero di mutanti desiderato nella raccolta finale basato su applicazioni a valle. Molti utenti richiedono semplicemente una libreria con i mutanti come molti come possibile. Per generare come molti inserimenti trasposone come teoricamente possibili (un inserimento ogni coppia di basi), obiettivo per approssimativoly lo stesso numero di colonie come coppie di basi nel genoma (cioè, ~4.5 x 10 6 per e. coli) completamente per saturare il genoma con tutti gli inserimenti possibili trasposoni. È importante notare che molti mutanti che harboring gli inserimenti in essenziale o funzionalmente importanti geni non sarà in grado di essere recuperati, come queste mutazioni sarà fatale per il destinatario. Calcolare quanto volume della libreria iniziale è necessaria per creare una biblioteca della dimensione desiderata. Ad esempio, la dimensione desiderata biblioteca è 5 x 10 4 mutanti. La diluizione con la migliore spaziatura delle colonie da 3,9 passo era 200 µ l di un 01:10 diluizione. Il numero di colonie su questa piastra è stimato essere circa 2.000 colonie. Se sono necessari 5 x 10 4 mutanti e ogni piatto ha 2.000 colonie, quindi 25 piastre saranno necessarie a questa diluizione. 5. Creazione della biblioteca mutante finale ripetere i passaggi 1 a 3,8, regolazione del numero di piastre a passo 1.4 come necessario (vedere il punto 4.4). Al punto 3.9, piastra la diluizione scelta nel passaggio 4.1 su come molti piatti come necessario per creare la libreria della dimensione desiderata (Vedi punto 4.4). 6. Stima della densità di libreria contare quante colonie ci sono per piastra e quindi ottenere una stima approssimativa di quanto densa la libreria è. Ad esempio: un totale di 2 x 10 5 colonie sono placcati. Il genoma di MG1655 di e. coli è circa 4,5 x 10 6 paia di basi. Di conseguenza, una biblioteca con circa 2 x 10 5 inserti significa che c’è un inserto in media ogni 22 paia di basi e che ogni gene dovrebbe essere mutato circa 45 volte, dato che un gene è circa 1 x 10 3 paia di basi. Inserimenti in geni essenziali sono suscettibili di essere molto sottorappresentati in questa libreria, e così la densità nei geni non essenziali rischia di essere superiore a questo. Questa sorta di calcolo fornisce uno con un’ampia stima della densità di trasposoni. 7. Pool di trasposone biblioteca e deposito dopo il conteggio colonie, aggiungere 1 mL di LB (o più, se necessario) alla piastra di biblioteca e usare una spatola sterile per grattare via i batteri dalla piastra. Rimuovere la sospensione batterica e posto in un flaconcino da 50 mL o 15 mL conico. Ripetere per tutte le piastre. Vortex la sospensione di batteri riuniti per un minuto per omogeneizzare la sospensione. Aggiungere glicerolo sterile ad una concentrazione finale del 20%. Preparare aliquote di µ l 100 x 20 in provette da 0,25 mL per facile ri-crescita. Preparare almeno due o più 1ml aliquotare in cryovials. Conservare tutte le aliquote a -80 ° C