כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.
רנ א העברה (tRNA) היא חלק חיוני של מכונות translational ב מכל יצור. tRNAs לאגד, להעביר חומצות אמינו הריבוזום התרגום. רמות היחסי של tRNAs שונים, ואת היחס בין aminoacylated tRNA ל tRNA סה כ, המכונה רמת הטעינה, הם גורמים חשובים בקביעת את הדיוק ואת המהירות של תרגום. לכן, השפע ואת רמות טעינה של tRNAs הם משתנים חשובים כדי למדוד כשלמדתי סינתזה של חלבון, לדוגמה בתנאים מתח שונים. כאן, אנו מתארים שיטה קציר tRNA ומדידת ישירות את השפע היחסי והן לרמה טעינה המוחלטת של מינים tRNA ספציפי של Escherichia coli. סינתזת האיסוף-כך הקשר יציב בין סינתזת של חומצת אמינו שלה נשמר. ה-RNA ואז נענשים בג’ל, צפון סופג, שתוצאתה הפרדה tRNAs טעון, לא טעונים. ניתן להשוות את הרמות של tRNAs ספציפיים בדגימות שונות בשל התוספת של ספייק תאים עבור נרמול. לפני טיהור RNA, נוסיף 5% של תאים e. coli תאגידי ענק בינלאומיים tRNAselC נדירים כדי כל דגימה. כמות המינים tRNA עניין במדגם ואז מנורמל לסכום של tRNAselC במדגם זהה. תוספת של ספייק תאים לפני טיהור RNA יש היתרון על תוספת של מטוהרים ספייק-in RNAs זה הוא גם מהווה ההבדלים יעילות פירוק התא בין הדגימות.
הבאות, אנו מציגים שיטה לכימות tRNAs ספציפיים, מדידת הטעינה שלהם רמות על ידי סופג בצפון ‘. השיטה מבוססת על טכניקה שפותחה על ידי. Varshney et al. 1. מאת קציר תאים לתוך חומצת חומץ טריכלור (TCA) ולשמור את הדגימות ב-0 מעלות צלזיוס במהלך הטיהור RNA, אסתר הקשר בין של tRNA, חומצת אמינו ביותר הוא שנשמרת2,3,4. Aminoacylated tRNAs ניתן להבדיל בין המקבילים nonacylated על ידי אלקטרופורזה בג’ל סופג בצפון, בשל ניידות ירידה של aminoacylated סינתזת הג’ל, הנגרמת על ידי חומצת אמינו מאוגד covalently5. בנוסף, אנו מציגים עבור נרמול tRNA כמויות על ידי תוספת של ספייק תאים overexpressingselC tRNA נדירות 4פרוטוקול.
tRNAs הם חלק המולקולות הנפוץ ביותר של התא חיידקי לבין תפקיד חיוני ביותר של מכונות תרגום. tRNAs לאגד חומצות אמינו ומעבירים אותם אל הריבוזומים התרגום. הכריכה של חומצות אמינו כדי tRNAs (aminoacylation או טעינה) בהנחייתם של aminoacyl tRNA synthetases. שפע יחסי של tRNAs טעון שונים חשוב להבטחת נאמנותם של סינתזת חלבונים, כי underrepresentation של cognate טעונה ש-trna עבור codon RNA שליח נתון (mRNA) מגבירה את הסבירות tRNA בקרבת מקום ל- cognate בטעות לספק שלו חומצת אמינו פוליפפטיד גוברת על הריבוזום6. החשיבות של tRNA טעונה באה לידי ביטוי נרחב התגובה של תא החיידק ירידה חמורה ברמות טעינה של tRNA; התגובה מחמירים. במהלך התגובה מחמירים הסינתזה של tRNAs, ribosomal RNAs mRNAs רוב הוא הוריד לטובת שעתוק של mRNAs ספציפיים הקשורים ההישרדות ביוסינטזה ומתח חומצת אמינו, קצב גדילת התאים היא יורדת באופן דרמטי7 . יתר על כן, עבודה על-ידי, ואחרים הראו כי e. coli פעיל מבזה הרוב המכריע של tRNA שלה בתגובה מדגיש כי להגביל תרגום4,8, רומז כי ייתכן ההתאמה של רמות tRNA חשוב להתמודדות עם לחצים כזה. לפיכך, אמין מדידות של רמות tRNA abundances וטעינה יהיה כלי חשוב להבנת מלא תגובות הלחץ חיידקי.
E. coli הוא נפוץ לבטא חלבון רקומביננטי, עקב הבדלים השימוש codon בין המינים, שיוצרת הביטוי הוא בעיה בפני9. זה אוכל מצויין הביטוי של tRNAs נוספים הדרושים כדי לתרגם את ה-mRNA רקומביננטי10. מדידות של tRNA טעינה רמות זנים כאלה יכול להנחות המאמצים לפתרון בעיות ולעזור למטב את ביטוי חלבון.
שיטה זו גם מאפשרת הגילוי של “mischarging”; מולקולת tRNA aminoacylated חומצה אמינו בלתי-cognate. Aminoacylation על ידי חומצות אמינו שונות עלולה לגרום של tRNA להעברת במהירויות שונות במקצת דרך לזיהוי ג’לים1,11. במקרים מסוימים, השיטה יכולה לשמש גם כדי להבחין בין דפוסי השינוי שונה על tRNAs אחרת זהה3.
עוד הקים הליך הביוכימי עבור החקירה של tRNA טעינה רמות הוא periodate חמצון. השיטה מסתמכת על התצפית כי aminoacylated tRNA מוגן מפני periodate חמצון ואינו tRNA לא טעונים. אחרי periodate חמצון טיפול לחידוש tRNA משמש להערכת רמת הטעינה הרנ א שנקטפו. עם זאת, לחידוש מספר tRNAs הוכח להיות מושפעות הטיפול ובכך לספק כמה דיוקים12. השיטה המוצגת כאן אמצעים טעינה ישירות מ- RNA מטוהרים, ובכך לא כולל שום הטיות של תגובות כימיות או אנזימטיות. מגבלה אחת של שיטה זו היא ובדיו tRNA אחד בלבד מזוהה בכל פעם, כך למרות הצפוני אותו כתם יכול להיות חשוף reprobed עבור tRNAs מרובות, זה במידת מה ההגדרה המפורטת לאסוף נתונים על tRNAs רבים.
דרך אמינה של נורמליזציה דוגמאות לשני חיוני בלימודי שבו המטרה היא להשוות בין רמות היחסי של מולקולה מדגמים שונים. כאן נסקור תהליך הנורמליזציה של רנ א שבו aliquot קטן של תאים e. coli overexpressing את סינתזת נדירselC נוסף של ספייק-in כל הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA. שיטה זו שימושית לא רק בעת בחינת tRNAs אך על כימות היחסי של כל המינים של RNA כאשר הגדרת הניסוי הוא כזה כי אין RNA אנדוגני ניתן לבטוח יהיה להציג ריכוז הסלולר זהה כל הדגימות. לדוגמה, הרמה של “משק”, כמו ה-RNA ribosomal RNA משמשת לעתים קרובות כמו הפניה אנדוגני להשוות כמויות יחסיות של RNA אחר בין שונים דוגמאות13. אבל זה לא ממש עוזר אם ריכוז RNA הפניה הסלולר משתנה בין דגימות, יכול להיות המקרה ribosomal RNA אם הדגימה מתרחשת במהלך16,17 15,התגובה מתח או במהלך כניסתו נייחים שלב17. התוספת של ספייק תאים כדי הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA מספק דרך מלא ומדויק של נרמול עצמאית של ההתקנה הדגימה. דרך נוספת של סטנדרטיזציה היא התוספת של אחד או יותר בספייק RNAs כדי הדגימות ניסיוני לאחר טיהור RNA. עם זאת, שיטה זו לא בחשבון ההבדלים ב RNA שחזור בין הדגימות.
באמצעות תאים e. coli overexpress את ההפניה RNA כמו ספייק תאים (ראה איור 1) בניסוי ב e. coli הוא החיסרון שנוצר זה בנוסף של כמות קטנה של אקסוגני e. coli סה כ RNA ל דוגמאות. אנחנו תקן עבור תוספת זו על-ידי ניתוח מדגם המכיל רק ספייק תאים במקביל הדגימות ניסיוני (ראה הצפוני כתם במסלול איור 2, עם התווית “selC”). פרוטוקול הציג זה פותח עבור e. coli K-12 אך צפוי להיות ישימים עבור רוב המינים חיידקי.
פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד בו זמנית את רמת הטעינה ספציפי e. coli tRNAs ולהשוות רמות היחסי של tRNAs בדגימות שונות. נקודות קריטיות של הפרוטוקול הם 1) להתמודד עם הדגימות בצורה כזאת, כי רמת טעינה סלולארית tRNA נשמרות, 2) לנרמל את סינתזת כמויות כך שניתן יהיה להשוות בצורה אמינה רמות היחסי tRNA בדגימות שו?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים מרית Warrer על סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הטבע [1323-00343B], קרן המחקר הלאומי הדני [DNRF120].
Urea | Merck | 57-13-6 | Purity >99% |
Polyacrylamide | Serva | 79-06-7 | |
Bis (N,N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
Phenol | Merck | 108-95-2 | |
IPTG | |||
Glucose | |||
Sodium Acetate | |||
EDTA | |||
Ethanol | |||
Tris | |||
Hydrochloric acid | |||
Sodium Chloride | |||
NaH2PO4 | |||
Sodium Citrate | |||
SDS | |||
Herring Sperm DNA | Sigma | 100403-24-5 | |
BSA | |||
Polivinylpyrrolidone | |||
Ficoll | |||
P32 γATP | Perkin Elmer | ||
DNA oligos (probes) | TAG Copenhagen | ||
Hybond N+ membrane | GE Healthcare | RPN203B | |
Crosslinker | |||
Electroblotter | BIO-RAD | ||
Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
Spectrophotometer | |||
Hydridization oven | |||
Geiger-Müller tube | |||
Phosphor imager screen | GE Healthcare | ||
Hybridization tube | |||
Culture Flasks | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
20 ml centrifuge tubes | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
ImageQuant | GE Healthcare | ||
Excel | Microsoft |