합성 아 밀 로이드 베타 단백질의 Intracerebroventricular 주입에 의해 쥐 동물 모델에서 Alzheimer의 질병의 귀중 한 모방의 설립
1Institute of Traditional Chinese Medicine,Chengde Medical College, 2Shijiazhuang Obstetrics and Gynecology Hospital, 3Hebei Province Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Against Dementia, 4Hebei Province Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development, 5Institute of Basic Medical Research of Basic Medical School
Summary
이 공간 메모리 손상, 신경 병리학 변화, 신경 아 밀 로이드 베타 단백질 (Aβ) 부담의 평가 의해 쥐에 있는 Alzheimer의 질병을 모방 하는 프로토콜 이며 neurofibrillary tangles 집계, Aβ25-35의 주입에 의해 유도 된 결합 알루미늄 trichloride와 재조합 인간 성장 인자 β1 변환.
Abstract
Alzheimer의 질병 (광고) 천천히 메모리를 파괴 하 고 신경 손실 및 구조 변경에 의해 동반 하는 돌이킬 수 없는, 진보적인 뇌 질환 이다. 전세계 광고 환자의 증가, 병 리과는 질병의 치료 국제 제약 산업에 초점을 맞추고 되고있다 합니다. 따라서, 실험실에서 광고를 모방 하기 위해 동물 모델 설립 매우 중요입니다.
여기, 우리가 쥐 동물에 광고의 모방을 설정 하기 위한 자세한 프로토콜 설명 하지만 아 밀 로이드 베타 단백질 25-35 (Aβ25-35) 알루미늄 trichloride (AlCl3)와 anterodorsal thalamic 핵 결합의 intracerebroventricular 주입 모델 재조합 인간 변형 성장 인자-β1 (RHTGF-β1) 쥐에 주입 광고의 관련된 마커를 포함 하 여 측정 되었다: 공간 메모리, 신경 구조와 구조, 신경 Aβ 및 neurofibrillary tangles (노퍽) 생산. 이 쥐 모델 공간 메모리 손상, 신경 구조와 구조 학적 변화, 신경 세포내 Aβ 부담, 및 NFT 집계 하며 임상의 신경 구조와 기능 장애의 가까운 모방 광고 환자입니다. 따라서,는 제시 광고 쥐 modelprovides 신경 기능, 신경 병 리와 광고의 마약 검사에 대 한 귀중 한 비보에 도구.
Introduction
그것은 잘 알려진 광고 주요 임상 증후군으로 점진적 메모리 손실만 성과 진보적인 신경 퇴행 성 질병 이다입니다. 일반 병리학, 신경 조직 위축, 신경 시 냅 스 손실 뿐만 아니라 신경 subcellular 구조와 기능 장애, 모든 개발 및 광고1,2의 임상 징후에 관련 된 있다. 그것은 동물 주사 Aβ intracerebroventricularly 때, 일부 신경 이벤트 신경 손실, 칼슘 항상성 장애, 신경 apoptosis 및 반응성 산소 종 과잉3를 포함 하는 두뇌에서 발생 보고. 그러나, 여러 요인 광고의 병 인에 관련 하 고 따라서 광고의 더 나은 모델을 확립이 필수적입니다.
자세한 프로토콜 설정 된 vivo에서 모방 광고 모델 Aβ25-35 및 AlCl3, anterodorsal thalamic 핵 주입 RHTGF β1의 쥐와 함께 intracerebroventricular 주사를 통해 여기 설명 되어 있습니다. 이 쥐 modelhighly 모방 인간의 신경 기능과 메모리 신경 손실 및 구조 손상, apoptosis, 세포 Aβ 부담 및 NFT 집계4,,56 을 포함 하 여 광고의 histopathogenesis , 7 , 8 , 9. AlCl의3 성 Aβ, 형성에서 예금 된 Aβ를 방지 하 고 RHTGF-β1 예금 된 Aβ 생산을 홍보 하 고 광고 발생10을 용이 하 게 수 있습니다. 뉴런에 여러 가지 요인에서이 공격 광고의 여러 병은.
전체 실험 스팬 86 일: 그림 1 동물 수술, 동물 모델 심사, 동물 공간 메모리 테스트 및 견본 준비의 시간 포인트 실험 디자인의 타임 라인을 보여 줍니다. 작업의 첫 번째 날, RHTGF-β1 anterodorsal thalamic 핵으로 microinjected 이었다. 작업의 두 번째 날, Aβ25-35, AlCl3 했다 microinjected 측면 뇌 실에 매일 아침에 14 일 연속 및 오후에서 5 연속 일 각각. 모든 쥐 작업 후 45 일 동안 복구 허용 되었다. 모리스 물 미로 메모리 손상으로 성공적인 모델 쥐에 대 한 화면 하 고 쥐 공간 메모리를 평가 하기 위해 사용 되었다. 쥐 물 미로 하루, 2 시험 훈련의 4 일 연속을 받았다 그리고 훈련의 날 4, 쥐 메모리 장애에 대 한 모리스 물 미로 성과로 평가 했다. 모든 쥐 동물 모델 심사 후 37 일 먹이를 계속 했다. 쥐의 공간 메모리 작업 후 85 데 하루 79에서에서 이상의 7 일 연속 모리스 물 미로에서 시험 되었다. 모든 쥐 잘린 하루 86 뇌 샘플 준비에 의해 희생 되었다.
그림 1. 실험 설계 연대기 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Protocol
이 절차에 따라 규정의 실험 동물 관리는 국가 위원회의 과학 및 중국의 기술에 의해 1988 년 10 월 31 일에 발행 했다11. 과학자 들은 설립 및 그들의 기관 및 국가 동물 규제 기관에 의해 승인 지침을 따라야 합니다. 참고: 동물 및 regents: 4 개월 남성 Sprague-Dawley 쥐 (300-350 g)이이 실험에 대 한 공급 했다. 모든 쥐 그룹 (4 또는 5 새 장 당) 온도 23 ± 1 ° C 12 h 빛 어두운 주기와에 보관 되어 있었다. 음식과 물을 사용할 수 있는 광고 libitum했다. 쥐 절차를 수행 하기 전에 7 일 동안 주택 조건에 acclimatized 했다. Aβ25-35 1 mg/ml, 1 %DMSO 식 염 수에 용 해 되었고 sonicated 완전히 해산 때까지 초음파 발진기에서 5 분. AlCl3 와 RHTGF β1 각각 1% 및 0.1 mg/mL에서 염 분에 해산 했다. 콩고 레드, 실버 질산염 및 기타 화학 물질의 분석 되었고 일반 상용 소스 로부터 구입 했다. 1. 수술 참고: 20 남자 Sprague-Dawley 쥐 측면 뇌 실 및 anterodorsal thalamic 핵, 합성 Aβ와 microinjected 되었고 합성 Aβ 대우 그룹으로 지정. 또 다른 20 쥐 동일한 작업 테스트를 하지만 받은 0.1 %DMSO 염 microinjection, 그리고 가짜 운영 그룹으로 지정. 흡입에 의해 100 %isoflurane 쥐를 anaesthetize 하 고 뇌 Stereotaxic 기구에 억제. 수술가 위로 머리의 꼭지점에 모피를 면도 하 고 iodophor와 소독. 다음, 머리에 일회용 외과 수건 커버. 수술 사용 및가 위 중간 경도 calvaria 따라 머리 피부에 절 개를 확인 합니다. 피하 조직, 근 막, 출혈, 중지에 대 한 살 균 건조 목화와 함께 두개골 calvarium를 닦 고는 bregma 마커 펜으로 표시 합니다. 쥐를 참조 Stereotaxic 지도12; 뇌 원점으로 bregma 고려 하면 3 점, anterodorsal thalamic 핵 (광고) 표시 (후부 (P):는 bregma에 2.0 m m, 측면 (L):는 중간에 1.4 m m) RHTGF-β1 주입 및 측면 심 실 (LV) 지역 (나사 하나를 고정 후부 (P): bregma;에 0.8 m m 측면 (L): 중간 선 2.0 m m) Aβ25-35 및 AlCl3, 그리고 장소를 고정 하는 두 번째 나사를 주입 (정면 (F):는 bregma에 2.0 m m, 측면 (L): 중간 선 1.5 m m). 부드럽게와 함께 유연한 뼈, 두개골의 위의 3 개의 포인트에서 지정 된 3 개의 1 m m 직경 구멍을 드릴 (1.5. 단계). 찔 러 뇌 조직을 방지 하는 데 필요한 보다 깊은 나사 하지 않습니다. 출혈을 멈추게 하 고 살 균 건조 목화와 함께 반복적으로 두개골 표면 청소. 4.6 m m 깊이에서 뇌에 마이크로 주입 펌프에 연결 된 바늘을 삽입 하 고 부드럽게 주사 1 μ RHTGF-β1 (10 기) 광고 영역으로. 주입 후 바늘 2 분을 유지 하 고 천천히 바늘 (보충 파일 1) 밖으로 당겨. 광고 및 두개골의 장소를 고정 하는 두 번째 나사 포인트 지정 두개골에 두 개의 나사를 수정 (는 1.5에서 지정 되었다. 단계) 작은 드라이버와 함께. 찔 러 뇌 조직을 방지 하는 데 필요한 보다 깊은 나사 하지 않습니다. 정 맥 주입 시스템 (보조 파일 2) 조립 하십시오, 높은 압력에 의해 소독 후 가이드 정에 더미 cannula를 삽입. 4.6 m m에서 뇌에 스테인리스 스틸 튜브 가이드 정을 쥐 stereotaxic 기구의 정 보유자의 도움으로 두개골 구멍 (보충 파일 3)을 통해 라스베가스 지역에 넣습니다. 믹스 1 mL 당 1.5 g의 비율로 틀니 기본 물으로 틀니 기본 물자 가이드 정 플라스틱 받침대와 커버 피부 감염을 방지에 대 한 전체 피부 절 개까지 immobilizing 가이드 정에 대 한 두 개의 나사를 커버에 붙여넣기 넣어. 작업의 날 2, 쥐와 isoflurane 흡입 작은 동물 마 취 기계를 사용 하 여 anaesthetize. 더미 정 밖으로 그립니다, 그리고 가이드 정으로 내부 정을 삽입 하 고 고정 나사 고정 내부 정 나사. 내부 정을 폴 리 에틸렌 파이프 연결 microinjection 펌프를 설정 하 고 1 μ/분 Microinject Aβ25-35 나는 라스베가스에 AlCl3를 주입 속도 조절 4 μ g (1 μ) microinject Aβ25-35 isoflurane 마 취에서 오후에서 5 일 동안 매일 아침 3 μ AlCl3 (1%)에서 14 일 동안 매일. 주입을 완료 한 후 5 분을 기다려, 부드럽게 내부 정 밖으로 그릴과 가이드 정에 다시 더미 cannula를 삽입. (해당는 마지막 Aβ25-35의 주입 날) 하루 15 게시물 수술에 정 맥 주입 시스템을 해체. 조심 스럽게 제거 수술가 위, 집게와 틀니 기본 물자 고체, 두 개의 나사를 나사, 가이드 정 꺼내 betadine와 상처를 소독. 뼈 시멘트와 두개골의 구멍을 간단한 중단된 봉합 방법으로 피부를 봉합. 가짜 운영 그룹과 동일한 작업을 수행 하 고 microinject 0.1 %DMSO 염 분. 수술 후 간호 수술 후 2 쥐 감 금 소 당 하며 30 일 동안 음식을 제공.참고: 가짜 운영 그룹 살아 (90%의 성공률 작업), 18 쥐 그리고 합성 처리 Aβ 그룹에서 살아 (95%의 성공률 작업) 19 쥐. 2. 성공적인 모델 쥐와 모리스 물 미로 공간 메모리의 평가 대 한 심사 모리스 물 미로참고: 모리스 물 미로 쥐 공간 메모리13를 평가 하기 위해 사용 되었다. 모리스 물 미로와 50 cm 120 cm 직경 스테인리스 원형 탱크 이다. 제이 모 야14행동 신경 과학에 설명 된 “금 표준” 패러다임에 따라 물 미로 테스트 수행 되었다. 식용 색소를 몇 방울으로 수영장 물을 검게합니다 31.5 cm에서 물과 온도 23 ±의 깊이 유지 1 ° c. 수 면 아래 1.5 c m 원형 투명 플 렉 시 글라스 플랫폼을 설정 합니다. 물 미로 주위 모든 공간 신호는 가변 물 미로 테스트 동안 유지 합니다. 설명 데이터 컬렉션에 대 한 상상의 선을 수영장 같은 4 사분면으로 나눕니다. 물 미로의 첫 번째 사분면 (Q1)에 숨겨진된 플랫폼을 배치 합니다. 컴퓨터 기반 그래픽 분석 소프트웨어에 연결 된 물 미로에 비디오 카메라를 통해 동작 (대기 시간, 궤도, 또는 횡단 수로 측정)를 수영 하는 쥐를 캡처하십시오. 성공적인 모델 쥐 합성 Aβ 대우 그룹에 대 한 심사 수술 당일 45에 모리스 물 미로 메모리 손상으로 성공적인 모델 쥐에 대 한 화면 심사 비율 (SR)을 수집 하 4 일 연속에 대 한 교육을 수행 합니다.참고: SR 각 합성 Aβ 치료 쥐의 평균 대기 시간으로 정의 되 고 가짜 운영 그룹 쥐 물 아래 숨겨진된 플랫폼을 찾을 수의 표면에 물 하루 4 미로 훈련. “A”는 숨겨진된 플랫폼을 찾을를 각 합성 Aβ 치료 쥐의 평균 대기 시간 및 “B”는 하루에 4 교육, 다음 식을 물 미로의 숨겨진된 플랫폼을 찾을 수 쥐의 가짜 운영 그룹의 평균 대기 시간:SR 0.2 합성 Aβ 처리 한 쥐 보다 더 큰 때, 쥐 합성 Aβ 치료 쥐15의 장애인된 메모리와 성공적인 모델 쥐로 간주 되었다. 하루 동안 메모리 성능 2 실험의 데이터에 숨겨진된 플랫폼을 찾아야 쥐의 평균 값으로 계산 되었다. 모리스 물 미로 테스트 과정 쥐 물 미로 탱크 및 60 내 숨겨진된 플랫폼에 대 한 검색에서 수영 허용 되도록 설계 되었습니다 s. 쥐 60 내 숨겨진된 플랫폼을 찾지 못 했 경우 s, 다음 쥐 실험의 손으로 플랫폼에 지시 했다. 쥐 숨겨진된 플랫폼에 도달 하는 때 (독립적으로 또는 보조), 쥐 하 게 했다 거기 20 s. 다음, 쥐 탱크에서 제거 되었고 10에 대 한 물리적 복구 허용 2 실험 사이 s. 3. 신경 검사 하루 86 게시물 수술 isoflurane 마 취에서 잘린 (그림 1)에 의해 쥐를 안락사. 얼음에 뇌를 넣고 부드럽게는 raphe에 두 개의 반구를 분리. 받아 신경 hematoxylin 및 오신 (그는), 콩고 빨강, 또는 실버 질산염의 빛 microcopy 관찰에 대 한 4% 포름알데히드에 수정 고 시 chiasma의 왼쪽된 반구 얼룩 (섹션 4-6 참조). 2.5%도 전자 microcopy 관측 (섹션 7)에 오른쪽 뇌 해 마 CA1 영역을 수정 합니다. 앞에서 설명한16,17빛/전자 microcopy 샘플 준비에 대 한 뇌를 처리 합니다. 4. 신경 그 얼룩 증기 두건에서 증류수를 각 슬라이드 (각 20 분) 그라데이션 알코올 (100%, 95%, 90%, 80% 및 70% 알코올)를 deparaffinize. 되며 (0.5 %w / v)와 함께 3 분 stain 그리고 슬라이드에서 언바운드 염료를 제거를 수돗물으로 씻어. 1 알코올에 0.1% 염 산 린스 흠 없는 핵의 색상을 제거 하는 s. 배경 회전 빛 블루까지 2 분 동안 0.5% 암모니아 용액에 담가. 1 분 1% 오신와 얼룩입니다. 그라데이션 알콜 (70%, 80%, 90%, 95%, 및 100% 알코올)로 5 분 동안 탈수. 크 실 렌에서 고 수 설치 매체와 함께 탑재. 관찰 하 고 실험 설계에 눈을 멀게 하는 사람에 의해 광학 현미경으로 그 얼룩에 해 마의 중간 CA1 0.125 m m 및 400 x의 확대에서 대뇌 피 질에서 0.0352 m m2 의 살아있는 뉴런을 계산. 5. 콩고 빨강 얼룩이 신경 Aβ 부담 시 금에 대 한 증기 두건에서 증류수를 각 슬라이드 (20 분) 그라데이션 알코올 (100%, 95%, 90%, 80% 및 70% 알코올)를 deparaffinize. 20 분에 대 한 작업 솔루션 (0.5 g 콩고 빨강, 80 mL 메 틸 알코올, 20 mL glycerinum) 콩고 레드 얼룩. 5 분 동안 증류수에 씻어. 3 (0.2 g 알코올/100 mL 수산화 칼륨) 알칼리 성 80% 알코올 솔루션으로 신속 하 게 차별화 s. 두 번, 각각 증류수와 5 분 동안 린스. 길의 되며 3 분에 counterstain. 2 분 동안 수돗물에 씻어. 암모니아 물에 찍어 (수돗물을 잘 섞어 수산화 암모늄의 몇 방울을 추가) 30 s 또는 섹션 푸른색까지. 5 분 동안 수돗물에 씻어. 그라데이션 알코올 (70%, 80%, 90%, 95%, 및 100% 알코올) 탈수. 크 실 렌에서 고 수 설치 매체와 함께 탑재. 관찰 하 고 실험 설계에 눈을 멀게 하는 사람에 의해 광학 현미경으로 400 x의 확대에 콩고 레드 스테인드 셀. 6. 실버 질산염 신경 NFT 형성 시 금에 대 한 얼룩 증기 두건에서 증류수를 각 슬라이드 (20 분) 그라데이션 알코올 (100%, 95%, 90%, 80% 및 70% 알코올)를 deparaffinize. 20% 실버 질산염 솔루션 및 상한 에이전트 어둠 속에서 20 분에 담가. 씻고 증류수에 두 번, 각 5 분. 실버 암모니아 용액에 담가. 20% 실버 질산염 용액에 암모니아 솔루션을 삭제 하 고 솔루션이 탁에서 명확한 때까지 추가. 동시에, 15 분 동안 유리 막대와 솔루션을 저 어 하 고 2 분 동안 수산화 암모늄 1% 희석에 넣어. 축 삭에 검은 블록 관찰 될 수 있다 때까지 3-7 분에 대 한 개발 작업 솔루션으로 슬라이드를 놓습니다. 1 분 동안 0.1% 희석 암모니아 용액에 담가 그리고 1 분 동안 물으로 린스. 2 분 동안 5% 나트륨 thiosulfate로 처분 하십시오 하 고 5 분 동안 물으로 린스. 그라데이션 알코올 (70%, 80%, 90%, 95%, 및 100% 알코올) 탈수. 크 실 렌에서 고 수 설치 매체와 함께 탑재. 관찰 하 고 실험 설계에 눈을 멀게 하는 사람에 의해 광학 현미경으로 실버 질산염 얼룩 400 x의 확대에 대 한 셀을 기록. 7. hippocampal 신경 열 대권 외의 측정 쥐 해 마 CA1 여러 조각 (1 m m3x 1 x 1)으로 잘라내어 2 h 4 ° c.에 대 한 2.5%도 (PH 7.2, 각 10 분) 시간 PBS 3를 가진 큐브를 씻어. 2 h 4 ° c.에 대 한 1 %osmic 산에 큐브를 해결 두 배 증류수 3에에서 큐브 린스 (각 10 분) x. 탈수 그라데이션 알코올 50%와 70%, 90% (각 10 분), 100% 두 번 (각 15 분). 프로필 렌 산화물 두 번 (각 15 분), 프로필 렌 산화물: 수 지 1:1 실내 온도에서 각 시간 (60 분), 그리고 프로필 렌 산화물: 수 지 1:4 (상 온에서 각 시간에 대 일 분)으로 교체 합니다. 수 지 (120 분, 실내 온도에)에 담근 다. EPON 812에 포함 하 고 유해 (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C). Semithin 섹션 (1 µ m), 메 틸 렌 블루, 얼룩 잘라내어 현미경 지역화. 울트라 얇은 섹션을 얼룩 (50 nm) uranyl-o-아세테이트와 리드 시트르산과. JEM-1400 전자 현미경 및 수집 이미지 검사 합니다.
Representative Results
모든 데이터는 평균 ± SEM. SAS/STAT 패키지 통계 분석 계산 하는 데 사용 되었습니다로 표시 됩니다. 메모리 수집 및 메모리 다시 학습 테스트에 숨겨진된 플랫폼을 찾을 수 대기 시간에 그룹 차이 양방향 분산 분석 (ANOVA) 반복 조치에 의해 분석 되었다. 프로브 재판과 신경의 수에서 그룹 차이 던컨의 다중 범위 테스트 뒤 일방통행 ANOVA로 분석 되었다. p < 0.05 통계적18고려 되었다. 합성 Aβ 대우 그룹에 대 한 메모리 손상으로 성공적인 모델 쥐에 대 한 심사: (그림 2AB1, AB2) 합성 Aβ 대우 그룹 쥐 쥐의 가짜 운영 그룹은 항상 자유롭게 수영 그림 2a a 1와 2AA2 쇼에 결과에 적응 수영 수영장 둘레의 주위에 항상 헤 엄는 모리스 물의 미로 메모리 장애 모델 쥐에 대 한 심사의 4 일 동안 모든 쥐 시간 (대기 시간) (그림 2B) 숨겨진된 플랫폼을 찾을 수를 점차적으로 감소 했다. 하루에 4 모리스 물 미로 훈련, SR (이 각 합성 Aβ 치료 쥐 및 숨겨진된 플랫폼을 찾기 위해 쥐의 가짜 운영 그룹의 대기 시간에 따라) 0.2, 보다 더 많은 경우 다음 합성 Aβ 치료 쥐 성공으로 간주 되었다 메모리 장애를 가진에 모델 쥐 각 그룹의 성공적인 모델 심사. 6 쥐를 전달 하는 작업에서 살아남은 19 쥐 (94.70%)의 18 다음 실험에 대 한 선정 됐다. 그림 2 . 합성 Aβ 대우 그룹에 메모리 손상으로 성공적인 모델 쥐에 대 한 심사 모리스 물을 사용 하 여 미로 훈련. (A) 적응형 수영 모리스 물 미로에서 쥐의 궤적. (AA2AA1-) 가짜 운영 그룹; (AB2AB1-) 합성 Aβ 처리 그룹입니다. (B) 평균 대기 시간이 모리스 물에 심사 평가판의 4 일 연속에 대 한 숨겨진된 플랫폼을 찾을 미로 가짜 운영 그룹 합성 Aβ 대우 그룹에 대 한 훈련. 그림 참조 4에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 합성 Aβ 쥐 메모리 수집 및 메모리 다시 학습 장애가 발생 합니다. 쥐 메모리 수집 위치 탐색 재판 하루 79와 80 게시물 수술에 대응 모리스 물 미로 시험 당일 1과 2에 의해 결정 되었다. 메모리 수집 시험의 2 일 동안 모든 쥐 찾이 숨겨진된 플랫폼을 점진적으로 감소 대기 시간 전시. 그림 3에서 보듯이, 숨겨진된 플랫폼을 찾기 위해 합성 Aβ 대우 그룹의 대기 했다 360.67%와 558.28% (F (1, 5) = 238.67, p < 0.01) 하루 1과 2의 모리스 물에 가짜 운영 그룹의 보다 큰 각각 테스트, 미로. 이 합성 Aβ 쥐에 메모리 수집 장애를 일으킬 수를 나타냅니다. 쥐 메모리 다시 학습 재판 하루 82, 83, 84 게시물 수술에 대응 모리스 물 미로 테스트의 하루 4, 5, 및 6에 반전으로 분석 했다. 그림 3에서 보듯이, 숨겨진된 플랫폼을 찾기 위해 합성 Aβ 대우 그룹의 대기 했다 가짜 운영 그룹 보다 306.20%, 650.16%와 936.92% 장시간 (F (1, 5) = 138.76, p < 0.01). 이 합성 Aβ 쥐 (그림 3)에서 장애를 다시 학습 메모리 상승 수 있습니다 보여 줍니다. 그림 3 . 합성 Aβ 쥐 메모리 수집 및 메모리 다시 학습 장애 발생. 위치 탐색 재판 모리스 물 미로 시험에서 1-2 일에 성과 수영 2 일 연속으로 메모리 수집을 평가 하기 위해 사용 되었다. 이들은 하루 79와 80 게시물 수술에 수행 했다. 재판 반전 메모리 다시 모리스 물 미로 테스트, 82, 83, 그리고 작업의 84 날에 대응에 하루 4, 5, 및 6에 점수를 수영 3 일 연속 학습 평가에 사용 되었다. 선 그래프 플롯 모리스 물 미로 테스트에 하루 1, 2, 4, 5, 및 6에 각 그룹에 대 한 숨겨진된 플랫폼을 찾을 수 평균 대기 시간을 표시 합니다. 데이터는 양방향 ANOVA로 분석 되었다 (일 그룹 x) 반복된 측정으로. 의미 ± SEM. n = 6. ** 0.01 < p 가짜 운영 그룹 대. 그림 참조 4에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 합성 Aβ 쥐 메모리 보존 장애 발생: 쥐 메모리 보존 모리스 물 미로 테스트 하루 81 게시물 수술에 대응의 3 일에 조사 재판에 의해 측정 되었다. 1 일 메모리 보존 시험, 합성 Aβ 대우 그룹 했다 더 적은 시간, 거리, 수영 수영과 이내 1 분기에서 수를 건너 s 대응 32.14%, 30.11%, 및 78.95% (p < 0.01), 각각의 그들 보다는 가짜 운영 그룹 (그림 44B). 이러한 결과 합성 Aβ 메모리 보존 손상 쥐에서 생성할 수 있다 보여준다. 그림 4 . 합성 Aβ 생산 쥐 메모리 보존 장애. 프로브 재판 1 일 하루 81 게시물 수술에 실시 되었다, 모리스 물 미로 테스트에 3 일에 성과 수영 하 여 메모리 보존 평가 하 사용 되었다. (A) 수영 시간, 거리, 수영 및 60에서 1 분기에 수를 건너 프로브 재판 (플랫폼)에 s. 데이터는 다중 범위 테스트와 일방통행 ANOVA로 분석 되었다. 의미 ± SEM. n = 6. ** 0.01 < p 가짜 운영 그룹 대. (B) 수영 프로브 시험에서 쥐의 궤적. (A) 가짜 운영 그룹, 대상 사분면 (Q1)에 큰 수영 시간 및 거리를 보여주는. (B) 합성 Aβ 대우 그룹, 대상 사분면 (Q1)에 적은 수영 시간과 거리를 보여주는. 그림 참조 4에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 합성 Aβ 쥐 수영 속도 영향을: 수영 속도 쥐 모리스 물 미로 테스트 하루 85에 대응의 7 게시물 수술 당일 시험 볼 수 플랫폼에서 계산 했다. 속도, 거리와 시간을 수영장에서 각 그룹의 플랫폼에 수영의 계산에 따라 수영 하는 쥐는 크게 달랐다. 따라서 속도 수영 하는 쥐에서 개별 차이 수 제외 동기 부여와 운동 능력은 기본적으로 모든 쥐 (그림 5)에 그대로 나타냅니다. 그림 5 . 합성 Aβ 쥐 수영 속도 영향을. 수영 속도 쥐 모리스 물 미로 테스트 작업 후 85 일에 실시 되었다 제 7 일에 시험 볼 수 플랫폼에서 계산 했다. 각 그룹의 속도 수영 하는 쥐는 크게 달랐다. 데이터는 다중 범위 테스트와 일방통행 ANOVA로 분석 되었다. 의미 ± SEM. n = 6. 그림 참조 4에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 합성 Aβ 쥐 신경 원 형태학 변화 발생: 모든 쥐 수술의 잘린 하루 86에 의해 사망 했다. 육안 검사는 노란색 표면 또는 얇은 또는 축소 된 대뇌 피 질 여러 합성 Aβ 치료 쥐에서 나타난 발견. 가짜 운영 그룹 (그림 6AA2)와 비교 하면, 그는 의해 합성 Aβ 대우 그룹의 광학 현미경 관찰 스테인드, neurofibrillary 변성, neuronophagia, 같은 hippocampal 신경 병리학 변화를 발견 핵 pyknosis, 그리고 핵 margination (그림 6AB2). 게다가, 합성 Aβ 치료 그룹에서 대뇌 피 질 부분 공개는 혼란된 된 세포 막, 조각난된 핵, 그리고 괴 지역 (에서 광범위 한 선 동적인 세포 침투가 특징 이었다 일반적인 colliquative 괴 사 그림 6A B3)입니다. 이 합성 Aβ 쥐에서 신경 구조 학적 부상에 발생할 수 있습니다 나타냅니다. 신경 구조, 가짜 운영 그룹과 비교의 병 적인 변화 뿐만 아니라 신경 수 또한 크게 해 마와 대뇌 피 질 (colliquative 괴 사 샘플)을 제외 하 고는 합성의 감소 했다 Aβ 대우 그룹입니다. 신경 수 63.86% (p < 0.01) 0.125 m m, hippocampal CA1 섹션에서 그룹을 운영 하는 가짜의 그것 보다 낮은 되었고 55.46% (p < 0.01) 낮은 0.0352 mm2의 대뇌 피 질 부분에서 (그림 6B)는 합성 Aβ에서 발생할 수 있습니다 제안 감소 신경 수입니다. 그림 6 . 합성 Aβ 쥐 신경 원 형태학 변화 발생. (A) 그로 얼룩진 hippocampal 및 대뇌 피 질 뉴런의 대표 이미지. (A 1-B1) 마 40 x; (A2-B2) 해 마 CA1 400 x; (A3-b 3) 대뇌 피 질 400 x입니다. (A3A1-) 가짜 운영 그룹; (B3B1-) 합성 Aβ 대우 그룹; 쇼 신경 손실, neurofibrillary 변성 (→), neuronophagia (←), 핵 pyknosis (↗), 중단 해 마, 일반적인 colliquative 괴 사 (★)에서 핵 margination (↙) 세포 막, 선 동적인 세포 침투의 큰 숫자를 표시 합성 Aβ 대우 그룹의 일부 대뇌 피 질. 눈금 막대에 A1 , B1 = 10 µ m; A3, A2, B2, b 3의 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 해 마와 대뇌 피 질, 가벼운 현미경 (400 x) 계산 했다 그 얼룩과 뉴런의 숫자. 각 볼륨 3 독립적인 샘플의 9 시각 필드에서 평균 ± SEM를 나타냅니다 (n = 3). ** 0.01 < p 가짜 운영 그룹 대. 그림 참조 4에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 전자 현미경 관찰 해 마 뉴런의 subcellular 열 대권 외. 합성 Aβ 치료 그룹 (그림 7B1-B4) hippocampal 신경의 구조 크게 파괴 되, 미토 콘 드 리아 붓기를 보여주는 고 cristae 파손, 증가 미토 콘 드리 아 전자 밀도, 거친 크기 바인딩과 그물, depolymerized polyribosomes, polymicrotubules, 일부 postsynaptic 밀도 (PSD), 많은 보조 리소좀, 및 세포질, 가짜 운영 그룹 (그림 7A1-A4)에 비해 침전 물 lipofuscin 핵 막 원유와 침 몰 한는 euchromatin 응축 되었고 변성, myelin 칼 집 레이어 했다 느슨한 또는 변성, 및 내부 축 삭 섬유 감쇠 했다. 이러한 결과 합성 Aβ 신경 하위 구조 손상 쥐에서 생성할 수 있습니다 보여 줍니다. 그림 7 . 전자 현미경 관찰에 의해 평가 hippocampal 신경의 subcellular 구조. A1-A4: 가짜 운영 그룹. 눈금 막대의 A1 = 4 µ m, 12, 000 x; A 2 의 눈금 막대 = 3 µ m, 15, 000 x; 눈금 막대의 A3 = 5 µ m, 10, 000 x; A4 의 눈금 막대 = 1 µ m, 35, 000 x. (B 4B1-) 합성 Aβ 처리 그룹입니다. (B1) 신경 및 핵 pyknosis (←), euchromatin 응축 또는 변성 (#), 사이토 피트의 팽창 (*), 높은 전자 밀도 미토 콘 드리 아 (▲), myelin 칼 집 레이어 느슨한 또는 감쇄 (→); (B2) 큰 GFAP, 높은 전자 밀도 미토 콘 드리 아 (▲), myelin 칼 집 레이어 느슨한 또는 감쇄 (), 큰 보조 리소좀 (↑), pericytes pyknosis, pericytes euchromatin 응축 또는 변성 (☆), 사이토 피트의 팽창 (*), 높은 전자 밀도 미토 콘 드리 아 (▲), 더 많은 lipofuscin (↓), myelin 칼 집 레이어 느슨한 또는 감쇄 (→). B4: 더 흥분 성의 신경 전달 물질 (#), 높은 전자 밀도 또는 부상 막 미토 콘 드리 아 (▲), synapsis 덜. 눈금 막대의 B1, B2 = 10 µ m, 5, 000 x; B 3 의 눈금 막대 = 5 µ m, 8, 000 x; B 4 의 눈금 막대 = 1 µ m, 40, 000 x. 그림 참조 4에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 합성 Aβ Aβ 부담 쥐 뉴런에서 발생: 콩고 빨강 얼룩이 감지 뉴런에 Aβ 부담 하 사용 되었다. 결과 합성 Aβ 특히 쥐 해 마와 대뇌 피 질 (그림 8A)에 세포내 Aβ 부담을 유발 수 보여 줍니다. 해 마와 대뇌 피 질 합성 Aβ 대우 그룹의 콩고 레드에 의해 스테인드 Aβ 레드 셀의 양수는 8.05-그리고 4.09 배 (p < 0.01) 가짜 운영 그룹 (그림 8B) 보다 더 큰. 이 합성 Aβ 쥐에서 신경 Aβ 부담을 늘릴 수 있는 방법을 보여 줍니다. 그림 8 . 합성 Aβ 신경 세포 쥐에 Aβ 부담 발생. (A) 대표 이미지 긍정적인 Aβ 신경 콩고 레드 해 마에 의해 스테인드 및 대뇌의 피 질. (-A1B1) 해 마 CA1 400 x; (A2-B2) 대뇌 피 질 400 x입니다. (A 1-A2) 가짜 운영 그룹; (B1-B2) 합성 Aβ 대우 그룹, 셀 스테인드 콩고 레드에 의해 긍정적인 더 Aβ를 보여 줍니다. 눈금 막대 = 10 µ m, 400 x. (B) Aβ 신경 해 마와 대뇌 피 질, 가벼운 현미경 (400 x) 계산 했다 콩고 레드에 의해 스테인드의 긍정적인 숫자. 각 볼륨 3 독립적인 샘플의 9 시각 필드에서 평균 ± SEM를 나타냅니다 (n = 3). ** 0.01 < p 가짜 운영 그룹 대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 합성 Aβ 쥐 신경에 있는 노퍽 증 착을 발생합니다. 실버 질산염 얼룩 뉴런에 노퍽 증 착 검출을 위해 사용 되었다. 결과 표시는 합성 Aβ 발생할 수 있습니다 눈에 띄게 세포내 NFT 증 착 쥐 해 마와 대뇌 피 질(그림 9). 해 마와 대뇌 피 질 합성 Aβ 대우 그룹의 실버 질산염으로 얼룩진 갈색 NFT와 셀의 양수는 9.75-그리고 4.82 배 (p < 0.01) 가짜 운영 그룹 (그림 9B의 그들 보다 더 큰 ). 이 합성 Aβ 쥐에서 신경 NFT 집계를 늘릴 수 있는 방법을 보여 줍니다. 그림 9 . 합성 Aβ 인 한 노퍽 집계 쥐 신경. (A) 해 마와 대뇌 피 질에 실버 질산염으로 얼룩진 긍정적인 노퍽의 대표 이미지. (A 1-B1) 해 마 CA1 400 x; (A2-B2) 대뇌 피 질 400 x입니다. (A 1-A2) 가짜 운영 그룹; (B1-B2) 합성 Aβ 처리 그룹입니다. 더 많은 노퍽 보여주는 긍정적인 셀 실버 질산염 합성 처리 그룹에 의해 스테인드. 눈금 막대 = 10 µ m, 400 x. (B) 긍정적인 NFT 뉴런의 숫자에 의해 스테인드 실버 질산염 해 마와 대뇌 피 질, 가벼운 현미경 (400 x) 계산 했다. 각 볼륨 3 독립적인 샘플의 9 시각 필드에서 평균 ± SEM를 나타냅니다 (n = 3). ** 0.01 < p 가짜 운영 그룹 대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
그것은 잘 알려진 학습 및 메모리의 손실 광고 환자2주요 임상 증상은. 여기 설명 하는 절차는 AD; 공부 하 비보에 방법 우리는 메모리 적자와 쥐 모델4신경 상해 완화 하는 약물을 테스트 하는 이전에 게시 프로토콜을 적응 했습니다. 우리의 프로토콜 성공적으로 모델 작업, 메모리 적자, 신경 상해, Aβ 부담 및 NFT 증 착, (현재 실험, 생존 율에에서 광고를 모방 하는 동물의 높은 생존 율으로 서 귀중 한 데이터를 얻기 위해 중요 한 정보를 제공 합니다. 그리고 작업의 성공적인 모델 율 90% 이상). 이러한 성공적인 모델 쥐 모리스 물 미로 테스트와 함께 그들의 공간 메모리를 측정 하기 위해 사용 되었다. 위치 탐색 재판 합성 Aβ 쥐 메모리 수집 장애;을 발생할 수 있습니다 발견 프로브 재판 합성 Aβ 쥐 메모리 보존;을 줄일 수 있다 발견 그리고 재판 반전 발견 합성 Aβ 쥐 재 학습 장애가 발생할 수 있습니다. 이러한 모리스 물 미로 테스트 데이터 표시 합성 Aβ 쥐 공간 메모리를 일으킬 수 있다. 전반적으로, AlCl3 및 TGF-β1와 함께 Aβ25-35 쥐 intracerebroventricularly 주입 가능 하 고 신뢰할 수 있는 비보에 광고 같은 동물 모델을 실험실에 대 한 만들었습니다.
이전 학문은 광고 환자의 두뇌 볼륨 10% 덜 건강 한 개인의 그것 보다는 보여주었다. 다양 한 atrophies 시각적 관찰에 의해 대뇌 반구에서 찾을 수 있습니다. 대뇌 피 질의 위축 정도 적극적으로 메모리 장애19관련이 있습니다. 조직학, 신경 손실과 심한 형태학 병리학의 많은 수는 직접 광고 환자20에 메모리 기능을 방해. 현재 연구에서 빛/전자 현미경 관찰 발견 합성 Aβ와 microinjected 쥐 신경 손실과 신경 및 subcellular 구조 중단을 포함 하 여 극적인 neuropathological 변화 표시. 이 결과 합성 Aβ에 의해 유도 된 쥐 공간 메모리 장애를 뒷받침 하 고 광고 환자의 상태와 비슷합니다.
그것은 잘 알려진 뇌 Aβ 부담 및 NFT 집계 광고에서 가장 중요 한 histopathogenic 특성 간주 됩니다. 그들은 수 있습니다 신경 구조를 파괴, 신경 신호를 방해, 신경 기능을 방해 하며 고급 치 매17. 현재 동물 모델 광고 환자 상태와 동의 하는 두뇌에 Aβ 및 NFT 집계를 발견. 따라서, 합성 Aβ에 의해 유도 된 쥐에 있는 현재 뉴런 부상 신경 병리학과 광고의 치료 전략을 모델로 사용할 수 있습니다.
다음은 상영 광고 쥐 모델에 약물 효과의 예: 자오 외., Scutellaria에서 모두 플 라 보노 이드 줄기와 잎 (SSF)와 쥐 메모리 및 apoptosis에 의해 유도 된 Scutellaria barbata (SBF) 감소 수를 보고 합성 Aβ8,9. Guo et al.를 또한 SBF NFT 집계와 타우 단백질, Ser199, Ser214, Ser202, Ser404, 및 Thr231에서 오버 인 산화를 억제 하 고 합성 Aβ 치료 쥐21에에서 GSK-3β, CDK5, PKA mRNA와 단백질 식 감소 수를 보고 . 동시에, 샹은 외, 또한 보고 및 효소 1 (BACE1) 고착 하는 β-사이트 APP mRNA 합성 Aβ 두뇌에서 표현의 쥐22사이토와 microglia 확산, 그리고 더 낮은 Aβ1-40, Aβ1-42, SBF 억제 수 있습니다. 위의 결과 바탕으로, 우리의 동물 모델 더 신경 기능 및 구조 장애를 포함 하는 다른 광고와 같은 모델에 비해 유리 하다.
다른 광고와 같은 모델에 관한 쥐에 Aβ의 단일 intracerebroventricular 주입 쥐 메모리 적자, 신경 손실과 neurogliocyte 확산, 발생할 수 있습니다 하지만 수 있습니다 또는 Aβ 및 NFT 증 착23없을 수도 있습니다. 높은 복용량 알에 노출 하는 쥐 두뇌에서 높은 성공률, 모방 광고, 그리고 메모리 신경 손실, neurogliocyte 확산, 그리고 치 패 (SP) 및 NFT 집계 비용 효과적인 동물 모델을가지고 나타납니다. 그러나, 알의 높은 복용량 쥐 간 상해를 초래할 수 있습니다 하 고 거식 증, 동반 감소 무게24. 세 쥐 또 다른 광고와 같은 모델입니다. 세 쥐 보여 메모리 적자, 신경 구조/구조 학적 변화, lipofuscin 증 착, Aβ 및 NFT 집계 없이. 24 개월 이상의 쥐 세가이 모델에 대 한 것으로 간주 됩니다 따라서 그것은 먹이의 더 긴 기간을 필요로 하 고 따라서 비용은 높은17,25입니다. SAMP8 및 APP 유전자 변형 마우스는 광고에 가장 가까운 모방 하 고 그들은 가장 이상적인 모델 광고 조사에 대 한. 하지만 두 동물 모델은 높은 가격 그리고 실험실26,27에서 사용 하도록 제한 됩니다. 위의 동물 모델에 비해, 합성 Aβ 치료 동물 모델의 우리의 모델은 낮은 비용과 높은 성능, 광고 공부를 위한 이상적인 도구를 만드는.
끝으로, Aβ25-35의 intracerebroventricular 주입 AlCl3 와 결합 하 고 TGF-β1 쥐에는 귀중 한 vivo에서 동물 모델 제공 더 나은 공간 메모리 손상, 신경 상해, Aβ 부담 및 NFT 증 착을 이해 하 기본 광고입니다. 이 모델 빠른을 제공 하 고 높은 동물 실험 프로토콜 비교적 간단한 생존 중복 될 더 경제에 있는 높은 속도 뿐만 아니라 속도 높은 모델 작업의 성공적인 속도. 현재 동물 모델 광고를 모방 하는 효과적인 모델 이며, 더 다양 한 다른 질병을 모방 하는 데 사용 되 고에 의해 자체을 확인할 수 있습니다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
허베이 성 자연 과학 재단 (No. 프로젝트 지원 C2009001007, H2014406048), 중국의 전통 의학 (No. 05027)의 허베이 지방 관리 및 허베이 성 대학, 중국의 주요 주제 건설 프로젝트.
Materials
| Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
| Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
| Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
| Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
| Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
| Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
| Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
| EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
| Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
| Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
| Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/ M3.5 |
| Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
| Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
| The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
| PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
| Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
| Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
| Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
| Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
| Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
| Zinc phosphate dental cement | Dental Material of Factory Shanghai Medical Instruments Co., Ltd. China | 201311 |
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Citar este artículo
Xiaoguang, W., Jianjun, C., Qinying, C., Hui, Z., Lukun, Y., Yazhen, S. Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer’s Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein. J. Vis. Exp. (137), e56157, doi:10.3791/56157 (2018).