في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة
Summary
وهنا يصف لنا أسلوب الذي يجمع في الموقع تيترامير MHC تلطيخ مع إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد الترجمة، والنمط الظاهري، وكمية محددة مستضد الخلايا في الأنسجة. هذا البروتوكول يستخدم لتحديد الخصائص المكانية والمظهرية لخلايا تي CD8 مستضد على حدة بالنسبة لنوع الخلية الأخرى والهياكل في الأنسجة.
Abstract
خلايا T حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات المناعية، بما في ذلك كشف والقضاء على الخلايا المصابة بالفيروس، ومنع المناعة الذاتية، ومساعدة في الإنتاج ب-الخلايا والخلايا البلازما من الأجسام المضادة، وكشف والقضاء على الخلايا السرطانية. تطوير MHC-تيترامير تلطيخ الخلايا T محددة مستضد تحليلها بواسطة التدفق الخلوي ثورة في قدرتنا على دراسة وفهم إيمونوبيولوجي خلايا تي. بينما مفيدة للغاية لتحديد الكمية والنمط الظاهري محددة مستضد خلايا T، التدفق الخلوي لا يمكن تحديد التعريب المكانية محددة مستضد تي الخلايا إلى الخلايا والهياكل في الأنسجة، وتقنيات التصنيف الحالية الأخرى لاستخراج تي الخلايا اللازمة للتدفق الخلوي محدودة الفعالية في الأنسجة غير اللمفاوية. في الموقع تلطيخ تيترامير MHC (IST) هو تقنية لتصور خلايا تي التي محددة لمولدات المضادات للفائدة في الأنسجة. في تركيبة مع إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة)، يمكن تحديد المحكمة العراقية الخاصة وفرة والموقع والنمط الظاهري لخلايا محددة مستضد CD8 و CD4 T في الأنسجة. هنا، نحن تصف وضع بروتوكول لوصمة عار وتعداد الخلايا التائية CD8 مستضد على حدة، مع تعمل محددة تقع داخل مقصورات الأنسجة محددة. هذه الإجراءات هي نفسها التي استخدمت في المنشور الذي صدر مؤخرا من لي et al.، بعنوان “الخلايا المنتجة” فيروس نقص المناعة القردي “في” المسام تقمع جزئيا “من CD8 الخلايا+ ” في فيفو “.” الأساليب المذكورة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنها يمكن استخدامها لترجمة، النمط الظاهري، وتحديد مقدار أساسا أي خلية CD8 T مستضد محددة تتوفر فيها MHC tetramers، في أي أنسجة.
Introduction
خلايا T حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات المناعية، بما في ذلك كشف والقضاء على الخلايا المصابة بالفيروس، ومنع المناعة الذاتية، ومساعدة في الإنتاج ب-الخلايا والخلايا البلازما من الأجسام المضادة، وكشف والقضاء على الخلايا السرطانية. تطوير ببتيد/MHC الفئة الأولى تيترامير تلطيخ محددة مستضد خلايا CD8 تي1 ووضع عهدا MHC الفئة الثانية تيترامير تلطيخ الخلايا CD4 تي2 بالتدفق الخلوي أحدث ثورة في قدرتنا على دراسة وفهم إيمونوبيولوجي خلايا تي. بينما مفيدة للغاية لتحديد الكمية والنمط الظاهري محددة مستضد خلايا T، التدفق الخلوي لا تسمح للكشف عن توطين المكانية محددة مستضد خلايا تي إلى الخلايا والهياكل في الأنسجة، والحالية الأخرى تقنيات تفصيل لاستخراج الخلايا T اللازمة للتدفق الخلوي محدودة الفعالية في الأنسجة غير اللمفاوية3.
نحن وآخرون تطورت أساليب استخدام الطبقة MHC الببتيد-تحميل الأول والصف الثاني تيترامير أو الكواشف مولتيمير بوصمة عار محددة مستضد خلايا CD8 و CD4 T في الأنسجة4،5،،من67، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-أساليب “هذه المحكمة الخاصة العراقية” السماح لتحديد موقع والوفرة، والنمط الظاهري لخلايا محددة مستضد CD8 و CD4 T في الأنسجة وتوفير وسيلة للكشف عن هذه الخلايا بالنسبة لخلايا وهياكل في الأنسجة أخرى. مجموعتنا وقد تستخدم على نطاق واسع MHC–أنا تيترامير تلطيخ لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز)-وفيروس نقص المناعة القردي (سيف)-الخلايا التائية CD8 محددة في الأنسجة اللمفاوية والأعضاء التناسلية والمستقيم اكتساب فهم لفيروس نقص المناعة البشرية وسيف إيمونوباثوجينيسيس وأن تحديد يرتبط التطعيم الناجحة استراتيجيات14،15،،من1617. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعنا أيضا أسلوب الذي يجمع بين المحكمة الخاصة العراقية في الموقع التهجين (العش) لتوطين والتحديد الكمي للخلايا التائية CD8 الخاصة بالفيروس والخلايا المصابة بالفيروس في الأنسجة وتحديد مستويات المستجيب للهدف في فيفو 18 , 19.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام MHC الببتيد-تحميل-أنا تيتراميرس وصمة عار محددة مستضد خلايا تي CD8 في أقسام الأنسجة الطازجة، إلى أنسجة كونتيرستاين استخدام المدينة، والتحديد الكمي للخلايا مع محددة تعمل في المقصورات الأنسجة محددة. هذه الإجراءات هي نفسها كما كانت تستخدمها لي et al., الذي حددنا الموقع والوفرة، والنمط الظاهري لخلايا تي سيف على حدة في الأنسجة اللمفاوية أثناء الإصابة المزمنة بسيف في ماكاكويس20في المنشور الذي صدر مؤخرا.
لتنفيذ هذا الإجراء، مقطوع الأنسجة الطازجة والمحتضنة بين عشية وضحاها مع MHC الببتيد-تحميل-أنا tetramers مترافق لجزيئات ثيوسيانات fluorescein (فيتك). ثم أنها ثابتة في بارافورمالدهيد. بعد تحديد الأنسجة، يتم تضخيمه الإشارة من MHC tetramers باستخدام الأجسام المضادة-فيتك أرنب والمحتضنة مع المعلمة فلوريسسينتلي أرنب المضادة الأجسام المضادة مفتش، وكذلك تضخيم الإشارة من تيتراميرس منضم. المدينة يستخدم بالاقتران مع المحكمة الخاصة العراقية لصفات محددة مستضد الخلايا T والخلايا المحيطة بها. الأجسام المضادة التي تعترف [ابيتوبس] على سطح الخلايا أو مدرجة في الفضاء خارج الخلية في الحضانة الأولية مع تيتراميرس. الأجسام المضادة التي تعترف بداخل الخلايا [ابيتوبس] تتطلب تخلل لجدار الخلية قبل التلوين. يتم تصويرها باستخدام مجهر [كنفوكل] أقسام النسيج الملون وتحليلها باستخدام البرمجيات [كنفوكل]. الخلايا المسماة كمياً باستخدام برامج الفحص المجهري [كنفوكل] أو إيماجيج. يمكن استخدام بروتوكول وصف وصمة عار أساسا أي خلية محددة مستضد تي CD8 في أي أنسجة للذي MHC–أنا تيتراميرس متوفرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
المحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة يوفر أداة أساسية لكشف وتميز، والتحديد الكمي للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في البيئات الأصلية مع السياق هياكل الأنسجة والخلايا الأخرى. هنا، يمكننا وصف إجراءات مفصلة للمحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة، متبوعاً بتحليل الصورة ال?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل “خدمة الصحة العامة” منح من “معاهد الصحة الوطنية” (T32 DA007097، R01AI096966، andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Referencias
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
