На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях
Summary
Здесь мы описываем метод, который сочетает в себе в situ MHC-Тетрамер пятнать иммуногистохимия для определения локализации, фенотип и количество антиген специфические Т-клеток в тканях. Этот протокол используется для определения пространственных и фенотипические характеристики антиген специфические CD8 Т-клеток по отношению к другой тип клеток и структуры в тканях.
Abstract
Т-клетки имеют решающее значение для многих иммунологических процессов, включая выявление и устранение инфицированные вирусом клетки, предотвращении аутоиммунные заболевания, оказание помощи в B-клетки и клетки плазмы производства антител и выявления и устранения раковых клеток. Разработка MHC-Тетрамер пятнать антиген специфические Т-клеток проанализирована подачей cytometry революционизировало нашу способность учиться и понимать иммунобиологии Т-клеток. Хотя чрезвычайно полезны для определения количества и фенотип антиген специфические Т-клеток, проточной цитометрии невозможно определить пространственной локализации антиген специфические Т-клеток в другие клетки и структуры в тканях и текущие методы дезагрегирования чтобы извлечь T клетки необходимы для проточной цитометрии ограничивают эффективность в не лимфоидной ткани. На месте MHC-Тетрамер окрашивание (IST) — это метод для визуализации Т-клеток, которые являются специфическими для антигенов интерес в тканях. В сочетании с иммуногистохимия (IHC) IST можно определить изобилие, местоположение и фенотип антиген специфические CD8 и CD4 T клеток в тканях. Здесь мы описываем протокол к пятно и перечислить антиген специфические CD8 Т-клеток, с конкретными фенотипов, расположенных в пределах конкретных тканей отсеков. Эти процедуры являются те же, что мы использовали в нашей недавней публикации Li et al., под названием «Обезьяний вирус иммунодефицита-продуцирующие клетки в фолликулах частично подавлен CD8 клетки+ In Vivo.» Описанные методы широко применяются, потому что они могут использоваться для локализации, фенотип и количественно практически любой антиген специфические CD8 Т-клеток для которой доступны MHC-тетрамера, в любой ткани.
Introduction
Т-клетки имеют решающее значение для многих иммунологических процессов, включая выявление и устранение инфицированные вирусом клетки, предотвращении аутоиммунные заболевания, оказание помощи в B-клетки и клетки плазмы производства антител и выявления и устранения раковых клеток. Разработка пептида/MHC класса I Тетрамер окрашивание антиген специфические CD8 T клетки1 и более последние разработки MHC класса II Тетрамер окрашивания клеток CD4 T2 подачей cytometry революцию нашу способность учиться и понимать иммунобиологии Т-клеток. Хотя чрезвычайно полезны для определения количества и фенотип антиген специфические Т-клеток, проточной цитометрии не позволяет для обнаружения пространственной локализации антиген специфические Т-клеток в другие клетки и структуры в тканях и текущий дезагрегирования методы для извлечения Т-клетки необходимы для проточной цитометрии ограничивают эффективность в не лимфоидной ткани3.
Мы и другие разработали методы, с помощью загрузки пептидной MHC класса I и класса II Тетрамер или multimer реагенты пятно антиген специфические CD4 T и CD8 клетки в тканях4,5,,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Эти IST методы позволяют для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 и CD4 T клеток в тканях и обеспечивать средства для выявления этих клеток относительно других ячеек и структур в тканях. Наша группа широко использовала MHC-I Тетрамер окрашивания для изучения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) – и обезьяний иммунодефицита (СИВ) – конкретных CD8 Т-клеток лимфоидной, половых органов и ректальной тканей, чтобы получить представление о ВИЧ и Сив иммунопатогенезе и выявления корреляты успешной вакцинации стратегии14,,1516,17. Кроме того мы также разработал метод, который сочетает в себе IST в situ гибридизация (ISH) для локализации и количественно вирус специфических Т CD8 клетки и клетки, инфицированные вирусом, в тканях и определить в vivo эффекторных до целевых уровней 18 , 19.
Здесь мы описываем протокол, с помощью загрузки пептидной MHC-I тетрамера пятно антиген специфические CD8 Т-клеток в разделах свежие ткани, чтобы изображение тканей с помощью IHC и дать количественную оценку клетки с конкретными фенотипы в отсеках конкретных тканей. Эти процедуры являются так же, как были использованы в нашей недавней публикации Li et al., в котором мы определили местонахождение, изобилия и фенотип SIV-специфических Т-клеток в лимфоидной ткани во время хронической инфекции SIV в макак20.
Для выполнения этой процедуры, свежие ткани секционного и инкубированы всю ночь с загрузки пептидной MHC-I тетрамера конъюгированных флуоресцеин тиоцианат молекулы (FITC). Затем они фиксируются в параформальдегида. После фиксации ткани, сигнал от тетрамера MHC усиливается с использованием антител анти FITC кролика и инкубировали с дневно меткой анти кролик IgG антитела, которые далее усилить сигнал от связанного тетрамера. IHC используется в сочетании с IST характеризовать антиген специфические Т-клеток и окружающие клетки. Антитела, которые признают epitopes на поверхности клеток или внеклеточного пространства, включены в основной инкубации с тетрамера. Антитела, которые признают внутриклеточных epitopes требуют пропитывание клеточной стенки до окрашивания. В разделах окрашенных тканей отражаются с помощью конфокального микроскопа и проанализированы с помощью конфокальной программного обеспечения. Приклеенные этикетку клетки являются количественно с помощью конфокальной микроскопии программного обеспечения или ImageJ. Описывается протокол может использоваться для пятна практически любой антиген специфические CD8 Т-клеток в любой ткани для которых MHC-I тетрамера доступны.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST, в сочетании с IHC обеспечивает важным инструментом для обнаружения, характеризующие и количественного определения антиген специфические CD8 Т-клеток в родной среде других клеток и тканей структур с контекстом. Здесь мы описали подробные процедуры для IST, в сочетании с МГС, следуют анал…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения гранты от национальных институтов здравоохранения (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Referencias
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
