Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

Sias zijn zure suikers die glycan ketens op glycoproteïnen op glycoproteïnen en glycolipiden in vertebraten omvatten. Sia expressie is gemodificeerd in kankercellen ¹ en correleert met progressie en / of metastase ^{2 , 3} . Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn Neu5Ac en zijn gehydroxyleerde vorm, Neu5Gc ² . Mensen kunnen Neu5Gc niet synthetiseren door een specifieke inactivatie van het gen dat codeert voor het CMAH-enzym. Deze niet-humane Sia bevat metabolisch in menselijke cellen als 'zelf', afkomstig van voedings Neu5Gc-rijke voedingsmiddelen ( bijv. Rood vlees) ^{4 , 5} . Neu5Gc is aanwezig op lage niveaus op de celoppervlakken van menselijke epithelia en endothelia, maar komt vooral bij carcinomen op. Neu5Gc wordt herkend als vreemd door het humane humoral immune system ^{2 , 6} .De antigeencomplexiteit van Neu5Gc-glycanen kan zich op meerdere niveaus voordoen, inclusief Neu5Gc-modificatie, koppeling, onderliggende glycanen en steigers, en hun dichtheid, die allemaal weerspiegeld worden door de complexiteit van anti-Neu5Gc antilichaamrespons bij mensen ⁶ . Sommige van deze antilichamen dienen als carcinombiomarkers en potentiële immunotherapeutica ⁷ . De komst van de chemo-zymatische synthese van verschillende sialoglycanen ⁸ heeft de weg geboden voor de diepgaande analyse van dergelijke antilichamen, gefaciliteerd door het gebruik van glycan microarray technologie ^{9 , 10} . Dus, met de gefaciliteerde voorbereiding en manipulatie van grote bibliotheken van natuurlijke en synthetische koolhydraten, zijn glycan microarrays een krachtige high-throughput technologie geworden voor het onderzoeken van de interacties van koolhydraten met een groot aantal biomoleculen ^{10 , 11 ,} </sup> ^{12 , 13} . In een matrixformaat worden minimale hoeveelheden materialen gebruikt, en dit multivalente display van biologisch relevante glycanen zorgt voor het onderzoek naar duizenden bindende interacties in een enkel experiment. Belangrijk is dat deze technologie ook kan worden toegepast op biomarker ontdekking en het controleren van immuunresponsen in diverse monsters ^{7 , 12} .

Succesvolle glycan microarray fabricage vereist het overwegen van drie belangrijke aspecten: het type printer robot, glycan conjugation chemistry en detectie optica. Met betrekking tot het afdrukinstrument zijn twee technieken beschikbaar: contact- en niet-contactprinters. In contactdruk worden 1-48 stalen pennen gedompeld in een multi-well bronplaat die glycanoplossing bevat en worden gespot op gefunctionaliseerde glijbanen door direct contact op te nemen met het glazen glijvlak. De oplossing bedraagt ​​deLevering aan de dia is een functie van de langdurige duur op het dia oppervlak. Meestal worden de monsters eerst voorgespoten op een glasblok (om homogene plekken te bereiken) voordat ze op het dia-oppervlak worden gedrukt. Bij niet-contactprinters ( bijv. De piezo-elektronische printer) worden de glycanen gedrukt vanuit een glazen capillaire met behulp van gecontroleerde elektrische signalen. Het elektrische signaal kan fijn gekalibreerd worden om nauwkeuriger afdrukken te verkrijgen ten opzichte van het afdrukken van contacten. De grootte en morfologie van de vlekken zijn ook relatief meer homogeen. Een extra voordeel is het recyclen van het monster terug naar de bronplaat na het afdrukken. Niettemin is het grote nadeel van piëzo-elektronische printers de drukknopbeperking (4 of 8), wat resulteert in een zeer lange drukduur, waarbij speciale aandacht moet worden besteed aan de stabiliteit, de temperatuur, de vochtigheid en de verdamping van het monster. De non-contact inkjetprinter vereist grotere voorbeeldvolumes ¹⁴ .

<p class = "jove_content"> In tegenstelling tot de beperkte beschikbare opties voor drukwerkmethoden, is de glycan conjugation chemistry een complexere overweging, met veel mogelijkheden om uit te kiezen. Geselecteerde immobilisatiechemie moet rekening houden met zowel de actieve groepen op de glycanen als de reactiviteit van de glijoppervlak. De glycanen die geïmmobiliseerd moeten worden op een specifiek microarray oppervlak, ofwel synthetisch gesynthetiseerd of natuurlijk geïsoleerd, hebben allemaal een identieke reactieve groep nodig. Bovendien moeten de glycanen zuiver en homogeen zijn. Aan de andere kant moet het immobilisatieoppervlak en de chemie reproduceerbaarheid en betrouwbare bevestigingsdichtheid verschaffen. Meerdere immobilisatiemethoden zijn ontwikkeld met ofwel covalente of niet-covalente (fysieke absorptie) bijlage ^{10 , 11 , 12 , 13} . Voor zeer gedetailleerde informatie over gedrukte glycan microarray technologie voor de oninitiateD-onderzoeker, verwijzen naar deze uitstekende beoordelingen ^{13 , 15} . Belangrijk is dat de recente Minimale Informatie Verplicht voor een Glycomics Experiment (MIRAGE) initiatief omschrijft richtlijnen voor steekproefbereiding ¹⁶ en voor het rapporteren van gegevens uit glycan microarray analyses ¹⁷ om de normen in dit groeiende veld te verbeteren.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de fabricage van sialoglycan microarrays met behulp van een specifieke contact nano-printer in een 16-vel formaat. Elk van de glycanen heeft een primaire amine die hun covalente verbinding met epoxy geactiveerde glazen glijbanen bemiddelt. We beschrijven ook de ontwikkeling en analyse van een dia met behulp van diverse menselijke sera-monsters, antilichamen en Sia-bindende plantentectines. Sialoglycan microarray analyses betreffen meerdere belangrijke stappen die matrix fabricage, verwerking, ontwikkeling en analyse omvatten. Array fabricage vereist de planning van de arRay-lay-out, bereiding van de glycanen en bronplaat, het programmeren van de nano-printer en het afdrukken van de dia's. Vervolgens worden de dia's verwerkt, ontwikkeld en geanalyseerd ( Figuur 1 ).