В пробирке Характеристика электрофизиологических свойств кишечных афферентных волокон в крыс
Summary
Аномальные сенсорные функции лежит в основе висцеральной боли и других симптомов заболеваний, функциональных и воспалительных кишечника. Протокол для электрофизиологических записи кишечных афферентных нервов в ex vivo подготовки colorectum крыса представлен здесь.
Abstract
Дисфункции кишечника сензорных нервах был вовлечен в патофизиологии ряд общих условий, включая функциональные и воспалительных кишечника заболевания и диабет. Здесь мы описываем протокол для характеризации в vitro электрофизиологических свойств толстой афферентов крыс. Colorectum, с нетронутым таза ганглии (PG) прилагается, удаляется из крыса; superfused с carbogenated Кребс решение в зале записи; и канюлированной на устные и анальный концах для растяжение. Тонкой нерва расслоение, вытекающих из PG идентифицируется, и состоящих из нескольких единиц афферентных нервов активность регистрируется с помощью всасывания электрода. Растяжение сегмента кишечника вызывает постепенное увеличение разряда, состоящих из нескольких единиц. Чтобы дифференцировать низкого порога, порог высокий и широкий динамический диапазон афферентных волокон проводится анализ главных компонент. Химические чувствительность толстой афферентов могут быть изучены через администрацию Ванна или внутрипросветная испытания соединений. Этот протокол может быть изменен для применения других видов, например мышей и морских свинок и изучить различия в электрофизиологических свойств грудо/подчревной и пояснично-крестцового/таза афферентов нисходящей ободочной кишки в нормальных и патологических состояний.
Introduction
Желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) богато иннервируются с внешние афферентные нервы, передать сенсорные сигналы от кишечнике центральной нервной системы и содействуют взаимодействию кишки мозг. Изменены возбудимости эти внешние афферентов, а также изменены центральной обработки афферентных входов, лежит в основе висцеральной боли и других симптомов GI условий, включая функциональные и воспалительных кишечника болезни1. Сенсорную информацию от colorectum передается главным образом через грудо/подчревной и пояснично-крестцового/тазовых нервов (PN)2. Наблюдается повышенный интерес к изучению электрофизиологических свойств этих первичных афферентных волокон в моделях грызунов болезни. Однако в естественных условиях электрофизиологических записи толстой афферентов грызунов технической задачей и требует значительных хирургических навыков. Кроме того изменения гемодинамики, движения ткани и анестетики могут также влиять нерва активности и чувствительности для тестирования раздражителей в естественных условиях. Таким образом в последние годы все большее число исследований использовали в пробирке (ex vivo) препараты разных видов, в том числе мышей, крыс, морских свинок, и людей, изучить механизмы сенсорных трансдукции в толстой афферентов и изменены возбудимости в условиях заболевания. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Главным образом были зарегистрированы два типа ex vivo толстой подготовки: «квартира лист» подготовка5,9,10 и3,подготовка «трубки»4. Видео-протокол для подготовки мышиных colorectum «плоским лист» был ранее опубликованных11. В этом протоколе, colorectum мыши, с PN) или поясничного чревного нервов (LSN) прилагается, собранный и superfused в камере ткани. Colorectum это продольно разрезать, и пучок нервных продлевается отсек запись, наполненный парафинового масла. Нерва действие записывается с помощью монополярный электрод платина иридий. Протокол позволяет для идентификации поля восприимчивы отдельных афферентных волокон с помощью беспристрастной электрической стимуляции. Он локализуется применение химических раздражителей, а также применение различных механических раздражений парадигмы (например, фокуса слизистой зондирующего и продольных стретч), чтобы афферентных нервных окончаний. Потому что нерв должна быть распространена на отдельной камере из ткани камеры, важно сохранить прилагаемый нерва относительно долго; успешное рассечение нервы представляет собой вызов для тех, кто новичок в этой методологии. Совсем недавно Nullens et al. опубликовал видео-протокол для записи в vitro брыжеечных афферентов в мышиных тощей кишки и толстой кишки сегментов12. В этом препарате «трубу» сегмента кишки с брыжейка придает хранится нетронутыми, таким образом позволяя градуированных растяжение и интра – и загородный просветный администрации различных химических веществ. Поскольку нерва брыжейка записывается с помощью всасывания электрод, который может быть расположен недалеко от ткани, афферентных деятельность может быть записан, хотя брыжейка нерва является относительно коротким. Однако, брыжейка нерв состоит из смешанных популяций позвоночника и блуждающего афферентных волокон, которые иннервируют тощей кишки или грудо подчревной. Пояснично-крестцовой области таза афферентов иннервируют colorectum, который не может быть подвергнут в настоящем Протоколе. Здесь мы представляем подробный протокол для электрофизиологических записи толстой афферентов крыс с помощью подготовки colorectum «трубки» с нетронутыми стр. Этот метод может позволить для описания функциональных свойств поясничный чревного (подчревной) и таза афферентов пояснично-крестцового отдела.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленные здесь является относительно простым экспериментальный метод для оценки электрофизиологических свойств толстой афферентов крыс. Протокол (от рассечение тканей для создания записи нерва) обычно занимает около 2 часов для завершения. Важнейшие шаги ткани колле?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот протокол был поддержан научно-исследовательских грантов от национального фонда Китая естественных наук (#31171066, #81270464) и китайско-немецкий научный центр (GZ919).
Materials
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
Referencias
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3. r. d., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neurociencias. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
