Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien
Summary
Der hier beschriebene modifizierte Hefe-Ein-Hybrid-Assay ist eine Erweiterung des klassischen Hefe-Ein-Hybrid- (Y1H) -Assays, um die heteromere Protein-Komplex-DNA-Wechselwirkung in einem heterologen System für jede funktionelle Genomforschung zu untersuchen und zu validieren.
Abstract
Im Laufe der Jahre hat sich der Hefe-Ein-Hybrid-Assay als eine wichtige Technik zur Identifizierung und Validierung von physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen wie Transkriptionsfaktoren (TFs) und deren DNA-Ziel erwiesen. Die hier vorgestellte Methode nutzt das zugrunde liegende Konzept des Y1H, wird aber modifiziert, um Protein-Komplexe, die an ihre Ziel-DNA binden, zu untersuchen und zu validieren. Daher wird es als der modifizierte Hefe-Ein-Hybrid (Y1.5H) -Assay bezeichnet. Dieser Assay ist kostengünstig und kann in einem regelmäßigen Laboratorium leicht durchgeführt werden. Unter Verwendung eines heterologen Systems könnte die beschriebene Methode ein wertvolles Werkzeug sein, um den heteromeren Proteinkomplex zu testen und zu validieren, der an ihre DNA-Ziel (e) für die funktionelle Genomik in jedem System der Studie, insbesondere der Pflanzengenomik, bindet.
Introduction
Im Allgemeinen, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu verstehen, ist der Y1H-Assay das bevorzugte System, das erfolgreich in einer Laboreinstellung verwendet wird 1 . Der basische Y1H-Assay umfasst zwei Komponenten: a) ein Reporter-Konstrukt mit DNA von Interesse erfolgreich kloniert stromaufwärts eines Gens, das für ein Reporterprotein kodiert; Und b) ein Expressionskonstrukt, das ein Fusionsprotein zwischen dem interessierenden TF und einer Hefe-Transkriptions-Aktivierungsdomäne (AD) erzeugt. Die DNA von Interesse wird gemeinhin als "Köder" bezeichnet, während das Fusionsprotein als "Beute" bekannt ist. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Versionen des Y1H-Assays entwickelt, um den spezifischen Bedürfnissen mit ihren eigenen Vorteilen gerecht zu werden 2 . Der bestehende Y1H-Assay kann erfolgreich implementiert werden, um die Interaktion eines Proteins zu einem Zeitpunkt mit seinem DNA-Köder zu identifizieren und zu validieren, aber es fehlt die Fähigkeit, heterodimere oder multimere Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren.
"> Die hier beschriebene Methode ist eine modifizierte Version der vorhandenen Y1H, die es Forschern ermöglicht, gleichzeitig mehrere Proteine zu untersuchen, die an ihre Ziel-DNA-Sequenz (en) binden. Ziel dieses Assays ist es, das Protein von Interesse mit einer Aktivierungsdomäne (pDEST22: TF) und die Aktivierung der an einen Reporter fusionierten Kandidaten-DNA-Regionen in Gegenwart und / oder Abwesenheit des wechselwirkenden Protein-Partners (pDEST32ΔDBD-TF) im Hefe-System aus. Dieser Assay erlaubt es uns zu bestimmen, ob die Wechselwirkung zwischen diesen beiden ist Proteine sind für die Aktivierung des Ziels erforderlich, ein GATEWAY Klonierungs-kompatibles System und daher in einer regelmäßigen Laborumgebung möglich. Das Thisprotokoll basiert auf einer direkten Transformation, die die Einfachheit der Co-Transformation verschiedener TFs in einem Hefe-System ermöglicht So ist es eine vorteilhafte Strategie, die Proteinkomplexe, die an ihre möglichen DNA-Targets binden, für die in vitro molekulare und funktionelle Validierung zu bestimmenOder irgendein System. Aktuelle Techniken wie Tandem Affinitätsreinigung (TAP) sind kostspielig und arbeitsintensiv, erlauben aber den Nachweis von Protein-Hetrocomplexen im großen Maßstab 3 , 4 , 5 . Dieser modifizierte Hefe-Ein-Hybrid kann in einer regelmäßigen Laboreinstellung im kleinen Maßstab erfolgreich durchgeführt werden ( Abbildung 1 ) und ist auch kostengünstig. Der Y1.5H-Assay kann Forschern in der gesamten Gemeinschaft helfen, ihre Hypothese zu testen und zu validieren, um die Rolle der multimeren Protein-Komplexbindung an ein gemeinsames DNA-Ziel unter Verwendung eines heterologen Systems zu definieren. Basierend auf den Befunden konnte die Hypothese in vivo im bevorzugten Studiensystem validiert werden . In letzter Zeit haben wir diesen Ansatz verwendet, um die Rolle eines TF und seiner Wirkungsweise zu definieren, um die Blüte in Arabidopsis zu regulieren 6 .Protocol
Representative Results
Discussion
Das bestehende Y1H-Standardverfahren eignet sich zur Identifizierung einer einzigen Protein-Beute-Bindung an seinen DNA-Köder. Mit verschiedenen technischen Modifikationen wurde das bestehende System zur Definition von Transkriptionsregulierungsnetzwerken eingesetzt. Es ist jedoch bekannt, dass TFs als Teil von Komplexen mit zwei oder mehr TFs oder Proteinen fungieren, wobei nur ein Teil der TF an die DNA binden kann. Proteine oder TFs, die nur die Protein-bindenden Domänen besitzen und die Fähigkeit besitzen, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken SS Wang, M. Amar und A. Galla für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften der National Institutes of Health unter den Auszeichnungsnummern RO1GM067837 und RO1GM056006 (an SAK) unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.
Materials
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
Referencias
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