Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

dikkat: bakım ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile ele gerekir Biyogüvenlik seviye 2 sınıf patojenler grip virüsleri (örneğin, H1, H3) nüfus dolaşan vardır. İşleme virüslerin kurumsal inceleme Kurulu tarafından onaylanması gerekir. Aşağıdaki iletişim kuralı Sina Dağı, Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi. Not: viral çoğaltma inhibe HA özel antikorlar genellikle kategorize i) veya küresel baş üstüne reseptör bağlama sitesinin bitişik olarak bağlamak ve II) distal reseptör bağlama bağlama etki alanı küresel baş yan tarafında ve SAP bölge ha içerir. Reseptör bağlama sitesi hedef antikorlar nişan hedef hücre yüzeyinde sialik asit motifleri önlemek ve bir hemaglütinasyon inhibisyon (hı) yöntemi kullanılarak ölçülebilir. HI-negatif, antikorlar sapı özel antikorlar gibi hala viral çoğaltma inhibe olabilir ama sadece nötralizasyon deneyleri kullanarak değerlendirilebilir. 1. kategorize antikorlar HI ve dayalı nötralizasyon faaliyetleri HI tahlil bir 96-şey V-alt plaka, 1 x PBS 25 µL 2-12 sütunlarda ekleyin. MAb 7B2 (kafa özgü), 6F12 (SAP-özel) 23 ve bir izotip kontrol 100 µg/ml 1 x PBS ve aliquot 50 µL seyreltilmiş antikor hazırlıkları sütun 1 oranında seyreltin. Ayrıca 1 x PBS ( şekil 1A) 50 µL ekleyerek mAb kontrolümü dahil. Sütun 2 sütun 1 25 µL aktararak antikorların logosuna 2 kat seri dilutions gerçekleştirmek ve böyle devam eder. Son 25 µL sütundaki 12 ( şekil 1A) atın. Not: antikor kontrol bir satır eklemek emin olun. 8 hemaglütinasyon birimleri/25 seyreltilmiş µL virüs hisse senedi için virüs hisse senedi (HA ve NA in A/California/04/09 ile iç kesimleri A/Puerto Rico/8/34 ifade reassortant virüs) oranında seyreltin. Her şey (satır A G) seyreltilmiş virüs stokunun (8 hemaglütinasyon) 25 µL ekleyin. Not: Son hacmi 50 µL 50 µg/mL başlangıç son konsantrasyon ile antikor ve virüs karışımı olmalıdır. Incubate 45 dakika süreyle (RT) oda sıcaklığında plaka İçin geri titrasyon satır (H), 1 x PBS 50 µL wells H2 H12 için ekleyin. H1 iyi 8 hemaglütinasyon birimleri/25 µL 100 µL ekleyin. Seri olarak iki kat için H2 H1 50 µL aktararak sulandırmak ve böyle devam eder. Son 50 µL iyi H12 üzerinden atmak. Son olarak, 96-şey V-alt plaka bütün wells için 50 µL % 0.5 tavuk kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ekleyin. Not: Son hacmi 100 µL tahlil mAb örneklerinde olmalıdır: mAb (25 µL), virüs (25 µL) ve RBC (50 µL). MAb kontrol son hacim içermelidir 1 PBS x 25 µL, şunun 25 µL ve RBC 50 µL. Incubate 4 ° c için 1 h. plaka Görsel olarak HI etkinliği için tabak okuyun. Belirli bir antikor için olumlu bir okuma, adım 2.1 kaçış türevlerini oluşturmak için devam edin. Antikor HI-negatif ise, aşağıda antikor hücre kültür tahlil aktivite nötralize varsa değerlendirmek için 1.2 adıma devam. Not: Koyu kırmızı RBC Pelet 96-şey V-alt plaka bir 45 ° açıyla yükleyen bir gözyaşı damla oluşturacak bir kuyu ( şekil 1B 7B2) ortasına bir HI-aktif mAb olumlu bir okuma simgesiyle gösterilir. Negatif bir okuma ( şekil 1B 6F12 ve hiçbir mAb) iyi bir koyu kırmızı RBC Pelet formu değil. İzotip kontrol de koyu kırmızı RBC Pelet oluşturacak değil ve göz sapı özgü antikor, 6F12 veya yok mAb aynı örnek ( şekil 1B) 23 kontrolü. Microneutralization tahlil 2 x 10 4 hücreleri/iyi bir doku kültürü’yoğunluğu plaka Madin Darby köpek böbrek (MDCK) hücreleri 96-şey plaka tedavi ve 37 ° C ve % 5 CO 2 17-19 saat için kuluçkaya . Not: Hücreleri de 4 h kullanmadan önce en az kuyunun uymak için izin. Yedi ayrı bir 96-şey tabak içinde gerçekleştirmek insan mAb 4D 3 kat seri dilutions 05 5, CR9114 17 veya izotip IgG kontrolde, 200 µg/tosyl ile desteklenmiş mL 1 X en az gerekli orta (MEM) bir başlangıç konsantrasyonu phenylalanyl chloromethyl keton (TPCK)-tedavi tripsin (1 µg/mL) ( Şekil 2). Not: Satır A 75 µL seyreltilmiş antikor (200 µg/mL konsantrasyonu başlayarak) içermelidir. Seri olarak (3-fold) 25 µL A satırdan satır B için transfer ederek plaka sulandırmak ve böyle devam eder. Satır A h 50 µL son hacmi olmalıdır. İpuçları seyreltme transferler arasında değiştirmek için gerek yoktur. Seyreltik virüs hisse senedi (HA ve NA in A/Shanghai/1/13 iç kesimi A/Puerto Rico/8/34 ile ifade reassortant virüs) 0 50 doku kültürü bulaşıcı doz (TCID 50)’e / 1 x 50 µL MEM takıma TPCK tedavi ile Tripsin (1 µg/mL) 24. 50 µL/iyi seyreltilmiş virüsü antikoru hazırlıkları (Adım 1.2.2) ekleyin. Hastalık bulaşmamış tek hücre kontrol wells için 1 X MEM 50 µL ekleyin. Kuluçkaya virüs-antikor karışımları için 1 h. (%5 CO 2 ile) bir 37 ° C kuluçka Not: Virüs-antikor karışımları 100 µL toplam hacmi olmalıdır: antikor seyreltme (Adım 1.1.2) 50 µL ve 100 TCID 50 (Adım 1.2.3) içeren virüs 50 µL. Kuyu medyada Aspire edin ve virüs-antikor karışımları tüm 100 µL eklemek için karşılık gelen wells. Not: Aspirasyon yapılır 8-kanal aspiratör bağdaştırıcı kullanan bir Vakuma bağlı. Alternatif olarak, bir 8 veya 12 de çok kanallı mikro pipet el ile Aspire için kullanılabilir. Gerek değiştirmek için ipuçları olmadan inoculum Temizleme ve yıkama sırasında tüm aspirasyon antikor en yoğun en düşük yapılır. Monolayer 1 x PBS 200 µL ile yıkayın. 1 x PBS (aynı derecede içinde adım 1.2.5) 200 µL Aspire edin. Çamaşır, bir kez daha iki yıkar toplam için yineleyin. Bulaştırmak monolayer tüm 100 µL/kuyusu monolayer ve bulaştırmak/kuluçkaya 37 ° C’de (ile % 5 CO 2) 1 h. için virüs-antikor karışımları (Kimden adım 1.2.4) ekleyerek MDCK hücre Ayrı bir 96-şey plaka enfeksiyon sırasında antikor dilutions başka bir dizi hazır olun. 150 µL ekleme satır a ilgili antikor 100 µg/mL ve 1 x 100 µL MEM ile TPCK tedavi tripsin (1 µg/mL) satırları b H. gerçekleştirin 3 kat dilutions 50 µL A satırdan satır B için transfer ederek takıma , ve benzeri, aşağı satır H. atma satır H. gelen son 50 µL Her biri için Toplam hacim de 100’e eşit µL. kenara. Not: Antikorlar MEM takıma TPCK tedavi tripsin ile (1 µg/mL) 1 x seyreltilmiş. Virüs-antikor inoculum kimden adım 1.2.7 monolayer Aspire edin ve tüm 100 µL/kuyusu 1.2.8 adımda hazırlanan uygun antikor seyreltme ile doldurmak. Not: Eğer iyi yeten 100 µg/mL son antikor konsantrasyon enfeksiyon (Adım 1.2.7), o zaman Yenileyici medya sırasında aynı 100 µg/mL (Adım 1.2.8) son antikor konsantrasyon içermelidir. Incubate 24 h 37 ° C kuluçka (ile % 5 CO 2). 96-şey plakaları medyadan Aspire edin ve 200 µL/kuyu ile 1 x PBS üç kez yıkayın. Soğuk % 80 aseton -20, 1 h için 100 µL ile hücreleri tamir ° C. Not: Çift Kişilik distile (dd) H 2 O (örneğin, % 100 aseton 80 mL artı GKD 2 0 20 mL) % 80 aseton çözüm seyreltilmiş. % 80 aseton çözüm kullanmadan önce buzda soğutulmuş. 200 µL/kuyu 1 X PBS hücrelerle üç kez yıkayın. Plakayı 200 µL/iyi %5 süt ile 1 X PBS içinde seyreltilmiş ve plakaları RT için 1 h., kuluçkaya bloğu Biotinylated anti-grip nükleoprotein (NP) birincil antikor eklemek 100 µL seyreltilmiş 1:2,000 PBS/1% sığır serum albumin (BSA) x 1 ve kaplamalar, RT, 1 h için kuluçkaya Not: influenza B virüs için bir grip B virüs özel anti-NP antikor kullanılmalıdır. 1 x PBS ile plakalar üç kez yıkayın. Streptavidin-at turp peroksidaz (HRP) eşlenik antikor eklemek 100 µL 1:3,000 1 PBS/1% BSA x seyreltilmiş ve plakaları RT için 1 h., kuluçkaya 1 x PBS 200 µL pilakalar üç kez yıkayın. 100 µL/kuyuda HRP Substratı reaktif ekleyin ve dik, karanlıkta kuluçkaya Not: Kuluçka süresi (aşağıda) asidik durdurma arabellek toplamadan önce optimize edilmelidir. Genel olarak, 15-30 dakika yeterlidir. Gidermek 50 µL/kuyu ile reaksiyon 5 M HCL. Dikkat: 5M HCl gözler, deride ve müköz membranlarda hasara neden olabilir son derece korozif bir reaktif olduğunu. Bu reaktif eklenmesi uygun kişisel koruyucu ekipman ile Bacalı bir örtünün altında yapılmalı. Plakaları, 492 okuma nm ve arka plan (kandan hücreleri) kuyu çıkarma. Yüzde inhibisyon aşağıdaki formülle hesaplama: bir antikor nötralizasyon etkinlik (ve HI hareket yok), 2.2 tutamaçlarından varsa. Not: vitro nötralizasyon aktivite eksikliği antikorlar HI aktivite eksikliği. 2. Kaçış Mutant versiyonlarının üretimi Not: nötralize antikorlar veya HI aktivite eksikliği daha da aşağıda açıklanan belirli iletişim kuralları ile analiz. Protokolü 1: HI-pozitif/nötralizasyon pozitif antikorlar ( şekil 3A ) hazırlamak bir virüs hisse senedi 10 adet/mililitre (PFU/mL) 1 x PBS içinde şekillendirme 6 plak 400 µL cilt. Hazırlamak antikor konsantrasyonları artan ilgi, dört dilutions (örneğin, 0, 0.5, 0,05 ve 0.005 mg/mL), 1 x PBS seyreltme başına 100 µL hacmine. Not: Wild-tipi virüs her zaman paralel ve antikor yokluğunda passaged. Pasajlı bu virüsler dizisi kültür koşulları hücre ve mutasyonlar kaçış adaptasyon arasında ayrım yardımcı olacak. Mix 100 µL 10 6 virüs her antikor seyreltme 100 µL veya 1 x PBS 100 µL PFU/mL. Incubate 37 ° C kuluçka (ile % 5 CO 2) 1 h için. Girdap kısaca. Her karışımı 200 µL özel-patojen ücretsiz (SPF) embryonated tavuk yumurta enjekte. 37 ° C’de (CO 2) olmadan 40-44 h. için yumurtaları kuluçkaya En az 6 h 4 ° C’de kuluçka tarafından virüs bulaşmış-embryonated yumurta kurban Yukarıda açıklanan 24 , 25 olarak yumurtadan, sıvı allantoic hasat. 24 , 26 açıklandığı gibi hemaglütinasyon tahlil gerçekleştirin. Tüm allantoic sıvı preparatları hemaglütinasyon titreleri varsa 2 0.005 mg/mL 0.00005 mg/mL aralığında değişen antikor dilutions ile yineleyin. Not: Mevcut tüm virüs parçacıkları bir HI-pozitif antikor doyurarak bir konsantrasyon nötralize. Bu nedenle, antikor passaging içinde mevcut miktarını azaltmak gerekli olabilir. Onaylamak HI gerçekleştirerek kaçış türevleri tahlil 24 (Adım 1.1). Not: HI-aktif antikor HA nişan hedef hücrelerde sialik asit motifleri engelleyin. Bu nedenle, bir virüs onun soydaş antikor huzurunda RBCs (RBC Pelet varlığı) agglutinate yeteneğini kaybeder. Teorik olarak, HI-aktif antikor türevleri kaçış hala sialik asit motifleri bile onun soydaş antikor huzurunda bağlayabilirsiniz ve böylece RBCs (RBC pelet) agglutinate. Faiz antikor HI hala tespit ise, adım 2.1.2 antikor daha yüksek bir başlangıç konsantrasyonu ile kuralından yineleyin. Protokolü 2: HI-negatif/nötralizasyon-pozitif antikorlar ( şekil 3B ) Not: HI eksikliği antikorları nötralize karşı kaçış türevlerini oluşturmak için etkinlik, virüsü antikoru miktarda artan huzurunda passaged gerekir. 1 x 10 6 yoğunluğu bir 6-şey plaka plaka MDCK hücrelerde hücre/iyi ve en az 4 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) kuluçkaya. 10 virüs stok seyreltik 6 PFU/mL veya 1 önceki geçiş virüs x 500 µL birimindeki TPCK tedavi tripsin (1 µg/mL) ile MEM. Antikor (0,02 mg/mL orijinal geçiş için veya tüm aşağıdaki pasajlar için daha yüksek) 1 tek bir seyreltme hazırlamak MEM TPCK tedavi tripsin 250 µL birimindeki ile x. Mix 250 µL seyreltilmiş antikor (+ antikor) 250 µL ile seyreltilmiş virüs veya 1 250 µL MEM (antikor kontrol) x. Virüs-antikor karışımı bir 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) 30 dk için kuluçkaya. Bir cam Pasteur kullanarak ortamın pipet ve hücreleri monolayer 1 mL 1 X PBS ile yıkayın Aspire edin. Karışımlar kuyu içine 500 µL ekleyip bir 37 ° C kuluçka (ile % 5 CO 2) 1 h. için kuluçkaya 1 saat sonra 1 2 mL Wells’le ek MEM TPCK tedavi tripsin (1 µg/mL) ile x. , Cytopathic etkisi (CPE) mikroskop işaretleri için 48 saat sonrası enfeksiyon hücreleri denetleyin veya viral büyüme 26 algılamaya hemaglütinasyon tahlil gerçekleştirmek. Antikor ile desteklenmiş kültürlerde brüt CPE ise, birden fazla cryo-tüpler, etiket süpernatant hasat-80 mağazasında ve geçiş numarası ile ° C. Kaydetmek 100 µL MDCKs taze bir monolayer 2 mL 1 x ile enfekte süpernatant ile MEM TPCK-tripsin ve antikor ile desteklenmiştir. Her geçiş için bir antikor kontrol eklemeyi unutmayın. Not: antikor konsantrasyonu (her iki gün) sonraki pasajda iki kat (veya takdirine bağlı olarak araştırmacının) artırın. Virüs büyüme hala bile 0.6 mg/mL antikor son bir konsantrasyon ile uygun olana birbirini izleyen her pasajda antikor konsantrasyonu artırmak. Birden çok şişeleri süpernatant her bir geçiş ve mağaza-80 donma ° C. Not: Antikor kontrol virüs diğerine bir geçiş büyüme doğrulama önemlidir. Hiçbir antikor denetimindeki brüt CPE ama hiçbir CPE ise + antikor grup, bu antikor konsantrasyonu çok yüksek ve hiçbir kaçış türevleri oluşturulan gösterir. Varsa CPE hiç antikor denetiminde brüt ama sadece CPE içinde orta + antikor grup, bu olası kaçış türevleri varlığını gösterir. Sonraki pasajda süpernatant ile 200 µL geçit birime artırmak ve kaçış türevleri oluşturma olasılığını artırmak için antikor konsantrasyonu korumak. 3. Yalıtım arınma kaçış türevleri ile plak 1 x 10 6 yoğunluğu bir 6-şey plaka plaka MDCK hücrelerde hücre/iyi ve en az 4 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) kuluçkaya. Seyreltik antikorlar 1 x 300 µg/mL 250 µL ve mix hacmine karşılık gelen kaçış mutasyona uğramış virüs 250 µL ile başlayan TPCK tedavi tripsin ile MEM. Antikor yokluğunda pasajlı virüs saf plak olmalıdır. Hücreleri medyadan Aspire edin, 1 x PBS ile üç kez yıkayın ve virüs-antikor karışımı (Adım 3.2) tüm 500 µL ekleyin. Plakayı 1 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) ileri geri sallamak her 10 min monolayer kurutma önlemek için emin olmak için kuluçkaya. Virüs-antikor karışımları Aspire edin ve kuyular antikor (300 µg/mL; adım 3.2) karşılık gelen miktarda içeren kaplama agar medya ile doldurmak. 40-44 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) plaka kuluçkaya. Görünür plaklar plak malzeme çekme kolaylaştırmak için mavi veya siyah renkli marker ile daire. Çekme dört plaklar her kaçış mutasyona uğramış virüs-antikor kombinasyonu gibi MDCK hücreleri veya yumurta antikor yokluğunda pasajlı vahşi tipi virüsler. 1 x PBS 100 µL içinde plak resuspend. Plak arıtılmış kaçış mutasyona uğramış virüs tüm 100 µL 10 – gün eski SPF embryonated tavuk yumurta enjekte. 40-44 h 37 ° C kuluçka (olmadan % 5 CO 2) için yumurta kuluçkaya. Virüs (Adım 1.1) varlığını doğrulamak için hemaglütinasyon tahlil gerçekleştirmek. 4. Ayıklama Viral RNA ve analiz, HA sıra değişkenlik 200 viral RNA ayıklamak µL kaçış mutasyona uğramış virüs allantoic sıvı fenol ve guanidin isothiocyanate mono-phasic çözeltisi ile. Dikkat: Fenol ve orta derecede temas ile cildi tahriş öksürük, nefes darlığı neden olabilir bir uçucu sıvı reaktif değil. Ters transkriptaz kullanımı ile viral RNA HA segmentten yükseltmek ve gene özgü astar grip A HA için segment 27. Not: Tablo 2’de açıklanan influenza B virüs evrensel astar iki HA yükseltmek (~ 1800 bp) ve NA (~ 1500 bp) 28. % 1’özel jel RT-PCR ürünü gidermek ve doğru ölçekli bant kesme (~ 1800 bp). Jel özü silis-membran dayalı arıtma yordamı kullanarak PCR ürünü ve cDNA sıralama için göndermek. Mutasyonlar ayırt tarafından antikor bağlama sözde kaçış varyant üzerinde bulunan ve vahşi-tipi virüs hücre kültür adaptasyon veya immünolojik seçimi nedeniyle pasajlı için gerekli amino asit kalıntı tanımlamak. Vahşi türünü içeren PCR ürünü klon veya değişken HA (yazmamalı ve NheI) bir pCAGGs ifade vektör kaçış. Antikor kaçış değişken HA için bağlama iki seçenekten birini (veya her ikisini birden) aşağıda açıklanan değerlendirildi. 5. Antikor bağlama analizleri kaçış türevleri bir yoğunluk 2 x 10 4 ayirt plaka 293T hücreleri hücre/iyi bir 96-şey tabak içinde ve (ile % 5 CO 2) 37 ° C kuluçka 24 h için kuluçkaya. 0.10 µg/iyi kaçış mutant HA kodlama pCAGGS plazmid hücrelerle transfect, virüs pasajlı HA ve vahşi-türü HA transfection reaktif (kullanımı ile unpassaged). 48 h 37 ° C kuluçka (%5 CO 2 ile) 96-şey tabakları kuluçkaya. Düzeltme ile 100 µL % 0.5 paraformaldehyde 15dk RT., için Dikkat: Paraformaldehyde bir uçucu sıvı reaktif ve orta derecede temas ile cildi tahriş öksürük, nefes darlığı neden olabilir olduğunu. Olası bir insan kanserojen belirlenmiştir. Ayrıca reaktif Bacalı kimyasal mahallede yapılmalıdır. Yıkama ile PBS 1 x üç kez. Blok 1 x PBS için 1 h dik olarak sütte % 5 ile 1 x PBS ile üç kez yıkayın. 5 µg/mL antikor RT. 1 h için ilgi ile kuluçkaya Incubate 1:2,000 1 PBS/1% BSA için karanlıkta RT, 1 h x seyreltme, ikincil antikoru (Anti-insan ya da anti-fare Alexa 488) 100 µL ile. 1 x PBS ile üç kez yıkayın. Pozitif veya negatif boyama için floresan mikroskop hücrelerdeyse gözlemlemek. Floresan aktif hücre sıralama (FACS) 2 x 10 5 yoğunluğu plaka 293T hücreleri hücre/6-şey tabak içinde iyi ve 37 ° C’de (%5 CO 2 ile) 24 h için kuluçkaya 0.50 µg/iyi hücrelerle kaçış mutant HA kodlama pCAGGS Plasmid’ler ile transfect, sadece virüs HA ve vahşi-türü HA transfection reaktif kullanımı ile pasajlı. 6-şey plakalar (ile % 5 CO 2) 37 ° C’de 48 h için kuluçkaya. 48 saat sonra büyüme medya Aspire edin ve 1 x PBS ile iki kez hafifçe yıkamak (monolayer bozulmamış olduğundan emin yapma). Hasat FACS arabelleği (1 PBS/2% fetal buzağı serum x) 500 µL transfected 293T hücrelerle. Not: FACS arabellek kullanmadan önce 4 ºC, önceden soğutulmuş olmalıdır. Hasat 293T hücreleri 300 x g 5 min için de 4’te santrifüj kapasitesi ° C. FACS arabellek Aspire edin ve mAbs ilgi (1-5 µg/mL son konsantrasyonu) içeren FACS arabellek 200 µL ile resuspend. RT 20 dk. için kuluçkaya Santrifüj kapasitesi 300 x g FACS arabellek 4 ° c yıkama iki kez ile 500 µL 5 min için de hücreleri. Dikkatli bir cam Pelet rahatsız olarak Pasteur pipet ile Aspire. Alexa 488 (1:1, 000 son seyreltme) Birleşik ikincil antikor içeren FACS arabelleği 200 µL ile resuspend. 20 dakika süreyle 4 ° C’de karanlıkta kuluçkaya Hücreleri FACS arabellek 4 ° c yıkama iki kez ile 500 µL 5 min için 300 gr, santrifüj kapasitesi ve dikkatle yıkama arabellek Aspire edin. FACS arabellek 500 µL içinde resuspend ve bağlama mAbs ve/veya poliklonal değerlendirmek sera hücrelere transfected HA FACS tarafından ile. Not: bir untransfected örnek yanı sıra mAb/poliklonal sera kontrolümü denemeye dahil unutmayın.