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Neurociencias

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

Published: August 09, 2017
doi:
10.3791/56063
, , , ,
1Brain Institute,Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering,ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience,Johns Hopkins University

Summary

En proyección de imagen es una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento celular en tiempo real. Aquí, describimos un protocolo para Time-lapse vídeo-microscopía de células de la corteza cerebral primaria que permite un examen detallado de las fases promulgadas durante la progresión del linaje de las células madre neurales primarias diferenciadas neuronas y glia.

Abstract

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las células progenitoras someterse a varias rondas de divisiones celulares simétricas y asimétricas para generar nuevos progenitores o neuronas postmitotic. Más tarde, algunos progenitores cambiar a una suerte de gliogenic, añadiendo a las poblaciones de astrositos y oligodendrocyte. Usando Time-lapse vídeo-microscopía de cultivos de células de la corteza cerebral primaria, es posible estudiar los mecanismos celulares y moleculares que controlan el modo de la división celular y parámetros de ciclo celular de células progenitoras. Del mismo modo, el destino de postmitotic células puede ser examinado usando reportero fluorescente específica de la célula proteínas o proyección de imagen la inmunocitoquímica. Más importante aún, todas estas características pueden ser analizadas a nivel unicelular, permitiendo la identificación de progenitores comprometidos con la generación de tipos celulares específicos. Manipulación de expresión génica puede realizarse también mediante transfección viral mediada, lo que permite el estudio de fenómenos celulares autónomos y célula autónoma. Finalmente, el uso de proteínas fluorescentes de fusión permite el estudio de la distribución simétrica y asimétrica de las proteínas durante la división y la correlación con el destino de las células hijas. Aquí, describimos el método de microscopia video Time-lapse para primaria corteza cerebral células murinas para hasta varios días de la imagen y analizar el modo de división celular, duración del ciclo celular y destino de las células recién generadas. También describimos un método simple para transfectar las células progenitoras, que pueden aplicarse para manipular genes de interés o simplemente etiquetar las células con proteínas de reportero.

Introduction

Las células madre neurales (NSC) generan neuronas y células macroglial durante el desarrollo de la corteza cerebral. En principios corticogenesis, NSCs someterse a varias rondas de división simétrica de la célula y amplían las progenitoras. Entonces, NSCs dividen asimétricamente para generar las neuronas directamente o indirectamente a través de productos intermedios1. Sólo en medio – al final-corticogenesis, progenitores cambiar para generar astrocitos y oligodendrocitos2,3,4. Sin embargo, los mecanismos de información que controlan la proliferación celular y diferenciación, así como la contribución de los progenitores sino restringida a la generación de tipos singulares de neuronas o células macroglial siguen siendo un asunto de intenso debate4,5,6. El potencial de generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos de NSCs corticales individuales ha sido extensivamente estudiado en vitro y en vivo con una gran variedad de técnicas tales como: vivir en culturas de célula de solo7,8,9,10,11,12,la13; en vivo imágenes de alta densidad culturas culturas3,14,15; en vivo imagen en rebanada culturas16,17,18; Análisis clonal con viral mediada por vectores genéticos etiquetado en culturas de alta densidad14,15,19,20,21; Análisis clonal en vivo utilizando retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; y análisis clonal en vivo mediante animales transgénicos34.

Cada una de estas técnicas presenta ventajas y desventajas. Por ejemplo, en vivo calco de linaje es susceptible a los reagrupamientos y división errores3, conduce a conclusiones contradictorias acerca del potencial de los progenitores corticales. Además, tanto estudios in vitro e in vivo basan en el etiquetado de células progenitoras en momentos tempranos y posterior análisis de linajes celulares pueden estar influenciada por la ocurrencia de muerte celular durante la progresión de linaje35. Por lo tanto, un sistema apropiado para analizar el potencial de NSCs solo debe permitir la identificación de todas las células que generan, así como la caracterización apropiada de los sinos de la célula dentro del linaje. Combinación de cultivo celular primaria y la proyección de imagen vivo proporciona esta configuración. Usando sola célula cultura y microscopia video Time-lapse, Templo et al han demostrado el interruptor en el linaje de los progenitores de la corteza cerebral individual de neurogénesis gliogenesis11. Más tarde, utilizaron el mismo sistema para demostrar que se generan diferentes tipos de neuronas de un solo progenitor cortical12. Sin embargo, este sistema presenta una importante salvedad: sólo 1% de progenitores corticales aislados en corticogenesis temprano generar clones de 4 o más progenie9. Después de la adición de FGF2, la frecuencia de las células generadoras de 4 o más células aumenta a 8-10%9. Sin embargo, este número es demasiado pequeño teniendo en cuenta que prácticamente todos los progenitores corticales son proliferativos en esta etapa. Por otra parte, los efectos potenciales de FGF2 en Especificación de destino no se puede descartar de36. Para evitar estas limitaciones, se utilizaron cultivos de células de alta densidad que apoyan la proliferación de ambos ventricular (expresión de Pax6) y subventricular de progenitores cortical (Tbr2-expresando)15. Por otra parte, la observación en tiempo real de estas culturas ha demostrado que varias características de la progresión de linaje del NSC se reproducen en estas condiciones, como modo de división celular, alargamiento del ciclo celular, potencial de las células para generar neuronas y glia, entre otros3,15. Más recientemente, también hemos utilizado este sistema para mostrar que CREB-señalización afecta la supervivencia de la célula de las neuronas de la corteza cerebral inmadura en ratones37. Por lo tanto, creemos que Time-lapse vídeo-microscopía de corteza cerebral murina primaria las células cultivadas en alta densidad es una herramienta poderosa y accesible para el estudio de mecanismos celulares y moleculares de la progresión del ciclo celular, el modo de división celular, supervivencia celular y especificación de destino celular. Este último se puede lograr mediante animales transgénicos, permitiendo la identificación de destinos específicos de la célula en tiempo real38,39,40 o el uso de la proyección de imagen immunocytochemistry3,38,41,42.

Presentamos un protocolo paso a paso para preparar el cultivo de células de la corteza cerebral primaria apoyando la proliferación de NSCs y la subsecuente generación de neuronas y células macroglial. También discutimos el uso de la transfección mediada por retrovirus para manipular la expresión genética de células individuales, que pueden ser identificados y rastreados a nivel unicelular usando microscopia video Time-lapse. Este protocolo se puede utilizar para el estudio de las células de la corteza cerebral primaria aisladas desde el principio hasta el final de la corticogenesis en roedores, pero unos pocos ajustes pueden ser requeridos según la etapa14. NSC aislado de otras fuentes también puede ser estudiada usando microscopia video Time-lapse de culturas 2D, pero el sistema de cultivo adecuado debe determinarse comparando celulares comportamientos in vitro e in vivo38,43.

Protocol

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected. 1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS…

Representative Results

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1). Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F…

Discussion

Observación en tiempo real de las células de la corteza cerebral primaria permite el análisis de la proliferación celular, el modo de división celular, duración del ciclo celular, diferenciación celular y la célula de supervivencia3,14,15,37. Lo más importante, permite el estudio de los linajes de unicelulares, conduce a la identificación de las fases intermedias promulgada durante la…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), cabos (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) y FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa Rio Grande do Norte).

Materials

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen Life Technologies 14175129
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) Gibco 12400-024
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437028
Glucose Gibco A2494001
B27 Gibco 17504044
trypsin-EDTA (0.05%) Gibco 25300054
Paraformaldehyde Sigma 16005
Goat serum Sigma-Aldrich 69023
Triton X-100 VWR International Ltd. 306324N
Isoflurane Sigma 792632
anti-MAP2, mouse Sigma M4403
anti-GFP chicken Aves 0511FP12
DAPI Sigma D9542
Goat anti-mouse alexa 594 Invitrogen A11005
Goat anti-chicken alexa 488 Invitrogen A11039
ImageJ NIH
tTt ETH Zurich
Cell observer microscope Zeiss
Pasteur pipette
PBS
The Tracking Tool (tTt) software https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html download link
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Referencias

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449 (2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76 (2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B., Doering, L. C. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. , 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

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Landeira, B. S., Araújo, J. A. d. M., Schroeder, T., Müller, U., Costa, M. R. Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System. J. Vis. Exp. (126), e56063, doi:10.3791/56063 (2017).
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