Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Deborah A. Sarkes; Justin P. Jahnke; Dimitra N. Stratis-Cullum

doi:10.3791/56061

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Bioquímica

Semi-automatique de criblage de bibliothèques d’affichage bactérienne pour Peptide affinité réactif découverte et l’analyse d’isolats qui en résulte

Published: December 06, 2017

doi:

10.3791/56061

Deborah A. Sarkes¹, Justin P. Jahnke¹, Dimitra N. Stratis-Cullum¹

¹Sensors and Electron Devices Directorate,US Army Research Laboratory

Summary

Protéines bactériennes affichage bibliothèques est une technique éprouvée pour la découverte des réactifs de peptide d’affinité, une alternative robuste aux anticorps. La méthode de tri semi-automatisée ci-après a rationalisé les protéines pour diminuer l’apparition de faux positifs. Nous illustrons ici le processus de pensée et des techniques appliquées à l’évaluation des candidats et en minimisant l’analyse en aval.

Abstract

Protéines bactériennes affichage bibliothèques est une technique éprouvée pour la découverte de réactif peptide affinité pour la reconnaissance de cibles biotiques et abiotiques. Peptide affinité réactifs peuvent être utilisés pour des applications similaires aux anticorps, y compris la détection et la thérapeutique, mais sont plus robuste et capable de fonctionner dans des environnements plus extrêmes. L’enrichissement spécifique des agents de capture de peptide à une cible de la protéine d’intérêt est améliorée en utilisant des méthodes de tri semi-automatisée qui améliorer la liaison et étapes de lavage et donc de diminuer l’apparition de fausses positifs liants. Une méthode de tri semi-automatisée est décrite aux présentes pour une utilisation avec un commercial automatisé magnétique-lancée de cellules tri périphérique avec un affichage bactérien sans contrainte tri bibliothèque exprimant des peptides au hasard 15-mer. Avec de légères modifications, ces méthodes sont extensibles à autre automatisé les dispositifs, autres bibliothèques de tri et d’autres organismes. Un objectif principal de ce travail est de fournir une méthodologie globale et expliquer le processus de pensée appliqué en analyse et en réduisant au minimum l’ensemble résultant des candidats. Ces techniques comprennent l’analyse des cellules le liaison à l’aide de cellule activée par fluorescence triant (FACS), afin d’évaluer l’affinité et spécificité au cours de triage et en comparant les candidats individuels, et l’analyse des peptides séquences pour identifier les tendances et séquences consensus permettant de comprendre et de potentiellement améliorer l’affinité et spécificité pour la cible d’intérêt.

Introduction

Biopanning est une technique éprouvée pour la découverte de réactif d’affinité, une bactérienne afficher bibliothèques une source commode de peptide affinité réactifs ¹^,²^,³^,⁴^,⁵^, ⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^, ¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^, ²⁴. De la même façon au phage afficher ²⁵^,²⁶ et levure affichage ²⁷^,²⁸, les peptides affleurent à la surface des cellules et sont disponibles pour lier à la fois biotiques et abiotiques cibles, avec ces interactions entraînée par l’épine dorsale de peptide et les propriétés uniques de l’acide aminé chaînes latérales ²⁹. Contrairement à l’affichage de phage, les bactéries elles-mêmes sont auto-répliquant et contiennent tout le matériel génétique nécessaire pour l’affichage sans l’élution du phage lié et une réinfection des cellules. Contrairement à l’affichage de la levure, affichage bactérienne est plus rapide en raison de la rapide (environ 20 min ³⁰) temps d’Escherichia coli. Les réactifs d’affinité peptide qui en résulte peuvent être produits hors-cellule, devant servir à une variété de plates-formes ¹⁶^,¹⁷^,²⁶ de détection et ont le potentiel d’utilisation comme matériaux vivants lorsque affiché sur cellules ² ^, ³¹ ^, ³². par rapport aux anticorps monoclonaux pour la reconnaissance de cibles précises, les peptides sont beaucoup plus petites et plus souples, et bibliothèques d’affichage de peptide peuvent être facilement manipulés au niveau de l’ADN afin d’éviter des acides aminés spécifiques, comme la cystéine ³³. Peptides sont plus en plus exploitées pour thérapeutique ³⁴^,³⁵^,³⁶ et d’autres applications où les anticorps seraient généralement utilisés grâce à leur facilité de découverte, reproductible synthétique (off-cellule ) production et entretien supérieur de performance dans des environnements extrêmes, fournissant un réactif fonctionnel même après une exposition à des températures élevées ou de stockage à long terme sans réfrigération ³⁷^,³⁸. La capacité de surmonter la chaîne du froid pour le stockage des réactifs est d’un intérêt particulier pour le ministère de la défense, par exemple, qui doit fonctionner dans des environnements extrêmes. Stabilité thermique est donc une caractéristique souhaitable pour les réactifs d’affinité reconnaissant les objectifs choisis donnés comme exemples dans ce manuscrit.

Récemment, les protéines bactériennes affichage bibliothèques est devenue encore plus simple et fiable avec l’utilisation de semi automatique cellule magnétique activé tri (MACS ou MCS) méthodes ⁹^,¹⁴^,³⁹. Ces méthodes ont été démontrés pour cibles biologiques à l’aide de plusieurs semblables plates-formes avec différents avantages, y compris un disponible dans le commerce de tri automatisé magnétique-lancée de cellules tri instrument (autoMACS ou autoMCS) (voir le tableau des matériaux) ¹^,¹⁴^,¹⁵ et des appareils plus spécialisés qui enferment l’échantillon dans une cartouche jetable ⁷^,⁹ ou puce ³⁹, un cahier des charges utiles pour utilisent avec les organismes ou les toxines qui sont de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ou plus⁷. Ces méthodes semi-automatisé pourraient être étendus pour trier des peptides capables de se lier aux matières abiotiques si magnétique ou qui ont la capacité d’être couché sur un billes magnétiques et pour utilisation avec différents organismes (tels que les bactéries anaérobies) si le tri et des conditions de croissance sont modifiées. En plus de bibliothèques d’affichage bactérienne de tri, l’instrument d’autoMCS commercial utilisé ici a également été utilisé en partie pour les premières étapes de la découverte de fragments d’anticorps humain de chaîne unique affiché sur l’aire de la levure, suivie d’une isolation supplémentaire à l’aide de Fluorescent tri pour les cellules d’activé (FACS) ⁴⁰. Les principaux avantages de semi automatisation sont diminuées de tri de temps et d’efforts et plus robuste et reproductible élimination des cellules non liés de billes magnétiques au cours des étapes de lavage, conduisant à la réduction des faux positifs, moins tours de tri requis et moins une analyse complexe en aval ⁹^,¹⁴. Dans le cas de l’instrument d’autoMCS commercial, il y a plusieurs programmes préchargés, qui peuvent être optimales pour différentes applications, telles que négatif prétri (épuisement), priorisant la pureté, en réduisant au minimum le volume de l’échantillon final et en augmentant ou diminution de sensibilité pour l’isolement de cellules rares ⁴¹.

L’objectif de ce travail est de démontrer la méthode de criblage une bibliothèque d’affichage bactérienne à l’aide de l’instrument d’autoMCS disponible dans le commerce et d’expliquer le processus de pensée appliqué en analyse et en réduisant au minimum l’ensemble résultant des candidats dans afin de faciliter l’extension à d’autres applications. La bibliothèque d’affichage utilisée ici (voir la table des matières) ¹²^,¹³ contient environ 10⁹– 10¹¹15-mer unique peptides affichées via une version modifiée de la protéine de membrane externe bactérienne OmpX dans un la nature sans contrainte à la surface de la cellule, qui est censée être représentatif du peptide libre en solution si fabriquée synthétiquement. En outre, cet échafaudage de protéine contient un peptide de contrôle positif P2X à l’extrémité C-terminale de surveillance expression via la liaison de YPet Mona. Toutefois, une bibliothèque achetée ou roman avec diversité appropriée et d’autres caractéristiques nécessaires pour l’application spécifique désirée devrait fonctionner de la même façon avec cette procédure de criblage, si des modifications mineures peuvent être requises. Une représentation schématique du présent protocole de criblage est illustrée à la Figure 1. En outre, le protocole pourrait être adapté aux autres automatisé des plates-formes de tri magnétiques et autres stratégies de tri. Un tri manuel magnétique d’un aimant de benchtop a été démontrée avec succès, bien que plus compliquée et fastidieuse analyse en aval nécessaire dû à accru faux positifs ¹⁴et fournit néanmoins une option alternative à la autoMCS pas si aucune cellule magnétique automatique dispositif de tri est disponible.

Protocol

1. protéines bactériennes affichage bibliothèques en utilisant autoMCS Remarque : Ce protocole de tri basé sur des autoMCS a été décrit précédemment 14, et un plus approfondi « élargi protocole pour les nouveaux utilisateurs » est disponible dans les documents complémentaires pour ce manuscrit pour plus de détails, y compris une explication du potentiel modifications. Si un dispositif d’autoMCS n’est pas disponible pour le tri, voir le protocole supplémentaire de Sarkes et coll. 2015 puisqu’un manuel de protocole de tri est également décrit dans ce travail 14. Le protocole d’autoMCS condition ici a été adapté pour inclure des étapes supplémentaires de tri négatifs pour spécificité améliorée 1,15. Une représentation schématique du présent protocole de criblage est illustrée à la Figure 1. Négatif de tri pour supprimer les liants susceptibles de provoquer une réaction croisée avec des billes magnétiques Inoculer 500 mL de bouillon de Luria Miller (LB) contenant approprié antibiotique avec environ 1 x 1011cellules d’une diversité bactérienne affichent bibliothèque de tri (voir table des matières).Remarque : L’affichage bactérienne peptide Bibliothèque utilisée ici (voir le tableau des matériaux) contient environ 109- 1011membres unique 8,12 et est cultivé dans des livres contenant du 25 µg/mL chloramphénicol (LB Cm25). Le reste du présent protocole suppose que cette bibliothèque est utilisée. Incuber à 37 ° C sous agitation à 225 tr/min, jusqu’à ce que la culture atteigne une OD600 de 0,5 – 0,55. Induire l’expression de peptide avec 0,04 % w/v L-arabinose en diluant un 4 % stock au 1/100, secouant à 225 tr/min pendant 45 min à 37 ° C. Place induite par la culture sur la glace. Centrifuger environ 2 x 1011 cellules à 6000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1,5 mL de PBS en agitant doucement.Remarque : Un OD600 de 1,0 équivaut environ à 1 x 109 cellules/mL pour e. coli.Remarque : ne pas VORTEX car cela peut lyser les cellules ; remettre en suspension à la main ou en secouant brièvement à ≤ 225 t/mn, 4° C. Cellules de transfert pour tubes de microcentrifuge et un essorage à 6 000 x g pendant 5 min à ta ou 4 ° C. Retirez le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 mL tamponné phosphate salin (PBS) contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA ; PBS-B). Laver 300 µL de streptavidine perles (environ 3 x 109 perles, voir table des matières) dans 1 mL de PBS-B et centrifuger pendant 5 min à ≥ 5, 000 x g (à la droite). Placer le tube dans un séparateur de particules magnétiques haut de banc. Retirer délicatement le surnageant, évitant le culot. Remettre en suspension les perles dans la cellule plus de mélange de PBS-B préparé ci-dessus. Incuber à 4° C sur une plate-forme tournante pour les échantillons lieu 45 minutes sur la glace. Allumez autoMCS instrument pour initialiser le système. Amorcer des lignes à l’aide d’exécuter du fabricant et des tampons de lavage (voir table des matières) en sélectionnant « Lavage Now » en bas de l’écran dans le menu de « Séparation », puis « Rinçage » et « Run ». Amorcez le système avec PBS-B, à l’aide de PBS-B en tant que tampon de lavage et tampon en cours d’exécution dans les prochaines étapes. Sélectionnez le menu « Séparation » dans la barre de navigation supérieure et sélectionnez « Lavage Now ». Sélectionnez « Rinçage » et « Run » pour amorcer le système avec frais PBS-B. Transférer le mélange cellulaire et le talon de l’étape d’incubation dans un tube conique de 15 mL. Placer ce tube dans la fente de l’échantillon et vider les tubes coniques de 15 mL dans les fentes de la sélection positive et négative, d’un support d’avance de frais (4 ° C) (voir la table des matières). Placez la grille sur la plate-forme de l’instrument. Attribuer un programme pour chaque échantillon sur la grille de départ (jusqu’à 5 échantillons peut être trié en un seul passage). Ajouter une étape de « Rinçage » entre chaque échantillon et après le dernier échantillon. Sélectionnez « Exécuter » pour démarrer la séparation de la cellule. Sélectionnez « OK » pour confirmer qu’assez tampon est disponible.NOTE : Le programme de séparation « Posselds » fonctionne bien pour tri négatif et positif tri 1 rond et « Posseld » est préférable pour le tri séries 2-4, mais ces deux programmes ont été utilisés avec succès pour tous les résultats négatifs et positifs tri tours 14 ,15 et autres programmes peuvent s’avérer préférable pour une application particulière (décrite plus loin dans la discussion). Lorsque le programme est terminé, retirer le panier et conserver la fraction appropriée. Ici, une sorte de négatif, conservent des fractions négatives (contenant des cellules sans perles). Placer sur la glace. Utiliser la fraction de tri négatif dans son intégralité pour ensemencer 1L de LB Cm25 avec 0,2 % p/v D-glucose. Cultiver une nuit à 37 ° C, secouant à 225 t/mn. Avant d’éteindre l’instrument autoMCS, changer les tampons exécution et laver à exécuter les directives du fabricant et des tampons de lavage (voir table des matières). Sélectionnez « Nettoyer maintenant », puis « Rincer » et « Run ». Lorsque vous avez terminé, n’oubliez pas il y a 70 % d’éthanol dans la ligne de décontamination, puis appuyez sur l’icône « power » en haut à droite de l’écran et sélectionnez « Oui ». Lorsque l’arrêt du système est terminé (les bouteilles sera pourpres), éteindre la machine. Le jour suivant, utilisez la culture pendant la nuit pour faire des stocks de congélateur avec environ 1 x 1011cellules par flacon dans LB avec 15 % de glycérol. En outre, ou, subsidiairement, utiliser cette culture à l’étape suivante : un tri négatif supplémentaire (section 1.2) ou la première série de positif tri (section 1.3). Tri pour supprimer les liants susceptibles de provoquer une réaction croisée avec les autres cibles d’intérêt négatifNOTE : La Section 1.2 peut être ignorée si aucune autre tri négatif est nécessaire ou souhaité. Dans ce cas, passez à la section 1.3. Liaison résiduelle pour toutes les cibles non désirés peut être évaluée par FACS article 2 : analyse des FACS de tours de tri. Pour le tri négatif contre une cible de protéines spécifiques, par exemple une protéine similaire pourrait également se lier à la découverte de peptides 1,15, répétez les étapes de croissance et induction 1.1.1 – 1.1.3, commençant par un stock congelé de streptavidine appauvri bibliothèque d’étape 1.1.15 ou la culture au jour le jour de l’étape 1.1.12 (à l’aide d’OD600 d’estimer et d’ensemencer avec des cellules de 1 x 10,11 ). Cellules de transfert pour tubes de microcentrifuge et un essorage à 6 000 x g pendant 5 min à ta ou 4 ° C. Retirez le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS contenant 600 nM biotinylé croisée la cible protéine. Incuber à 4 ° C pendant 45 min sur une plate-forme tournante.NOTE : 600 nM est une concentration de départ suggérée, qui peut être modifiée si on observe une prestation remarquable. Biotinylation des cibles protéiques peut être atteints et quantifiées à l’aide de réactifs indiquées dans le tableau des matériaux. Pendant ce temps, laver 100 µL de streptavidine perles (environ 1 x 109 ) dans 1 mL de PBS-B et centrifuger pendant 5 min à ≥ 5 000 x g (à la droite). Placer le tube dans un séparateur de particules magnétiques haut de banc et soigneusement enlever le surnageant, évitant le culot. Centrifuger les cellules cibles liés à 6 000 x g pendant 5 min (RT ou 4° C), éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS-B. Remettre en suspension les perles dans la totalité du volume des cellules lavées lié à la cible la protéine une réaction croisée. Incuber à 4° C sur une plate-forme tournante pendant 30 min. Placer l’échantillon sur la glace et suivez les étapes 1.1.7 – 1.1.15 pour une sorte de négative, faire des stocks de congélateur approprié. Continuer à la section 1.3 pour un tri positif si tous tri négatif désiré est atteint, ou répéter la section 1.2 sort négatif contre une autre protéine croisée potentielle. Ronde 1 tri positifNOTE : Round 1 tri positif contre une protéine spécifique cible est similaire au tri négatif contre une cible de tri spécifique (voir 1.2) sauf que la fraction contenant du talon, positive est conservée. Inoculer les 500 mL de LB Cm25 avec environ 1 x 1011cellules d’une diversité bactérienne d’affichage tri bibliothèque qui a été appauvri streptavidine et cultivées pendant la nuit (de l’étape 1.1.12) ou congelé (de l’étape 1.1.15) et décongelé sur glace, ou qui a été plus épuisés des liants d’autres cibles de protéine une réaction croisée (de l’étape 1.2.5), comme vous le souhaitez. Incuber à 37 ° C sous agitation à 225 tr/min, jusqu’à ce que la culture atteigne une OD600 de 0,5 – 0,55. Induire l’expression de peptide avec 0,04 % w/v L-arabinose en diluant un 4 % stock au 1/100, secouant à 225 tr/min pendant 45 min à 37 ° C. Place induite par la culture sur la glace. Centrifuger environ 2 x 1011 cellules à 6 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1,5 mL de PBS en agitant doucement (à la main ou en secouant brièvement à ≤ 225 t/mn, 4° C). Cellules de transfert pour tubes de microcentrifuge et un essorage à 6 000 x g pendant 5 min à ta ou 4 ° C. Retirez le surnageant. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS contenant 600 nM biotinylé la cible protéine d’intérêt. Incuber à 4 ° C pendant 45 min sur une plate-forme tournante.NOTE : 600 nM est une concentration de départ suggérée, qui peut être modifiée si on observe une prestation remarquable. Biotinylation des cibles protéiques peut être atteints et quantifiées à l’aide de réactifs indiquées dans le tableau des matériaux. Pendant ce temps, laver 100 µL de streptavidine perles (environ 1 x 109 ) dans 1 mL de PBS-B et centrifuger pendant 5 min à ≥ 5 000 x g (à la droite). Placer le tube dans un séparateur de particules magnétiques haut banc et retirer délicatement le surnageant, évitant le culot. Lors de l’incubation avec la cible est terminée, centrifuger les cellules cibles liés à 6 000 x g pendant 5 min (RT ou 4° C) pour éliminer toute protéine cible non lié. Éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS-B. Remettre en suspension les perles dans la totalité du volume des cellules lavées lié à la cible de la protéine. Incuber à 4° C sur une plate-forme tournante pour 30 min. Place sur la glace. Allumez autoMCS instrument pour initialiser le système. Amorcer des lignes à l’aide d’exécuter du fabricant et des tampons de lavage (voir table des matières) en sélectionnant « Lavage Now » en bas de l’écran dans le menu de la séparation, puis « Rinçage » et « Run ». Amorcez le système avec PBS-B, à l’aide de PBS-B en tant que tampon de lavage et tampon en cours d’exécution dans les prochaines étapes. Sélectionnez le menu de séparation dans la barre de navigation supérieure, puis sélectionnez nettoyer. Sélectionnez rinçage et Run pour amorcer le système avec frais PBS-B. Transférer le mélange cellulaire et le talon de l’étape d’incubation au-dessus d’un tube conique de 15 mL, rincer le tube avec une supplémentaire 500 µl de PBS-B et de mutualisation du lavage avec l’échantillon. Placer ce tube dans la fente de l’échantillon et vider les tubes coniques de 15 mL dans les fentes de la sélection positive et négative, d’un support d’avance de frais (4 ° C) (voir la table des matières). Placez la grille sur la plate-forme de l’instrument. Attribuer un programme pour chaque échantillon sur la grille de départ (jusqu’à 5 échantillons peut être trié en un seul passage). Ajouter une étape de « Rinçage » entre chaque échantillon et après le dernier échantillon. Sélectionnez « Exécuter » pour démarrer la séparation de la cellule. Sélectionnez « OK » ou « Continuer » pour confirmer qu’assez tampon est disponible.NOTE : Le programme de séparation « Posselds » fonctionne bien pour tri négatif et positif tri rond 1 et « Posseld » est préférable pour le tri séries 2-4, mais ces deux programmes ont été utilisés avec succès pour tous les résultats négatifs et positifs tri tours 14 , 15 et autres programmes peuvent s’avérer préférable pour une application particulière (décrite plus loin dans la discussion). Lorsque le programme est terminé, retirer le panier et conserver la fraction appropriée. Ici, une sorte de positif, conservent des fractions positives (contenant des cellules et des perles). Placer sur la glace. Avant d’éteindre l’instrument autoMCS, changer les tampons exécution et laver à exécuter les directives du fabricant et des tampons de lavage (voir table des matières). Sélectionnez « Nettoyer maintenant », puis « Rincer » et « Run ». Lorsque vous avez terminé, n’oubliez pas il y a 70 % d’éthanol dans la ligne de décontamination, puis appuyez sur l’icône « power » en haut à droite de l’écran et sélectionnez « Oui ». Lorsque l’arrêt du système est terminé (les bouteilles sera pourpres), éteindre la machine. Utiliser la fraction de tri positif dans son intégralité pour ensemencer 1L de LB Cm25 avec 0,2 % p/v D-glucose. Cultiver une nuit à 37 ° C, secouant à 225 t/mn. Le lendemain, utiliser la culture pendant la nuit pour faire des stocks de congélateur dans LB contenant 15 % de glycérol, et/ou continuer à positif tri 2ème tour à la section 1.4. Tours suivants de tri positifsRemarque : En général, quatre tours de tri sont recommandés, bien que trois tours de tri sont généralement suffisants 14,15. Quand arrêter le tri est secondé par l’analyse de FACS de tri tours décrits au point 2. Les concentrations de la cible et le volume de billes magnétiques diminuent avec chaque tour tri positif ultérieur. À l’aide de la culture au jour le jour de la tour de tri précédent (ou un stock de cellules congelées de ce tour), inoculer 5 mL LB Cm25 avec 100 µl de cellules (01:50 dilution). Incuber à 37° C sous agitation à 225 tr/min, jusqu’à ce que la culture atteigne une OD600 de 0,5 – 0,55. Induire l’expression de peptide avec 0,04 % w/v L-arabinose, secouant à 225 tr/min pendant 45 min à 37° C. Place induite par les cellules sur la glace.Remarque : Cette culture induite permet également d’évaluer l’affinité et spécificité pour la manche triage que provient, tel que décrit à l’article 2 ci-dessous. Centrifuger 1 x 108 cellules à 6 000 x g pendant 5 min à ta ou 4 ° C. Éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans 50 µL PBS contenant la moitié de la concentration de cible protéines biotinylées d’intérêt utilisé pour la série précédente de tri (donc 300 nM pour le 2ème tour, 150 nM pour le cycle 3 et 75 nM pour tour 4 de notre suggérée point de départ). Incuber pendant 45 min sur la glace (ou à 4 ° C, une plate-forme tournante). Pendant ce temps, laver streptavidine perles (15 µL de 2ème tour, 8 µL pour rondes 3 et 4 µL pour tour 4) dans 1 mL de PBS-B et centrifuger pendant 5 min à ≥ 5 000 x g (à la droite). Placer le tube dans un séparateur de particules magnétiques haut de banc et soigneusement enlever le surnageant, évitant le culot. Remettre les billes en suspension dans 50 µL PBS-B. Après l’incubation de 45 min avec la cible à l’étape 1.4.3, centrifuger les cellules à 6 000 x g pendant 5 min à ta ou à 4° C, retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans les 50 µL lavé des perles 1.4.4. Conserver l’échantillon sur la glace et suivez les étapes 1.3.7 – 1.3.13 pour une sorte de positive. Ensemencer une culture de 5 mL de LB Cm25 additionné de 0,2 % p/v D-glucose avec la fraction entière de positive, contenant des billes de la sorte. Le lendemain, utiliser la culture nuitée faire des stocks de congélateur dans LB contenant 15 % de glycérol et/ou continuer le tri positif prochaine ronde, en retournant à l’étape 1.4.1.Remarque : En utilisant la culture induite de 1.4.2 à évaluer affinité et spécificité comme décrit à la section 2 ci-dessous peut aider à déterminer quand arrêter le tri. Si deux tours tris d’affilée montrent une affinité semblable, ou un tour plus tard montre diminue l’affinité de liaison pour la cible d’intérêt, cela une souhaitable placer pour arrêter le tri. Après le dernier tour, retour à l’étape 1.4.1 mais arrêter à 1.4.2. 2. FACS Analysis of tours de tri En utilisant les cellules induites de l’étape 1.4.2 pour chaque cycle de tri, ou cultures identiques, ajouter 5 µL induite par les cellules à 25 µL de chacune des options suivantes pour la liaison d’évaluation des solutions préparées (voir aussi le tableau des matériaux) : PBS seul ; PBS avec 150 nM YPet Mona (YPet 12,13; contrôle positif pour l’expression), le cas échéant ; la cible de protéine 900 nM conjugué à un colorant fluorescent, tels que les amines-réactif colorant avec des émissions/excitation à 493 nm⁄518 nm (cible-488) ; 900 nM croisée protéine cible utilisée pour le tri négatif marqués par le même agent fluorescent (ont protéine-488) ; et 900 nM streptavidine-R-phycoérythrine (SAPE). Incuber sur glace pendant 45 min.Remarque : Si continuer directement à l’étape 1.4.2, cette étape sera toujours faire le lendemain, le criblage pour ce tour a été achevée depuis la bibliothèque sélectionnée vers le bas a été cultivée pendant la nuit se repiquées ensuite et induit le lendemain. Cultures cultivées et induit de même de stocks congelés de rondes tris peuvent également être utilisés ; dans ce cas, toutes les épreuves peuvent être testés et comparés dans une expérience simple. Cellules de centrifugeuse à 6 000 x g pendant 5 min à ta ou 4° C. Éliminer le surnageant et stocker des échantillons sur la glace.Remarque : Boulettes de cellule peuvent être stockés sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons sont prêts pour l’analyse. Allumez l’instrument de FACS, ouvrez le logiciel, la mise en service du système et calibrer l’instrument Suivant instructions 43,44 du fabricant. Dans le logiciel de FACS, cliquez sur « Administrateur » et cliquez sur le dossier souhaité ou créer un « nouveau dossier ». Cliquez sur la « nouvelle expérience » icône dans l’angle supérieur gauche de l’écran. Clic droit sur icône pour « renommer » expérience. Dans cette expérience, cliquez sur « Feuilles de travail Global ». Cliquez sur l’icône « Dot Plot », puis cliquez sur la feuille de calcul feuille de calcul global pour créer ce nuage de points. Cliquez sur le graphique de plot point lui-même, puis sélectionnez le « inspecteur » icône en haut à gauche de l’écran et régler les axes à bi-exponentielle affichage en sélectionnant les cases en regard de « Axe Y » et « Axe X » dans la fenêtre ouverte. Fermez la fenêtre d’affichage bi-exponentielle en cliquant sur le X. Créer un nouveau « Tube » en cliquant sur l’icône en haut à gauche de l’écran et renommez le spécimen avec les informations appropriées en cliquant sur l’icône de spécimen en vertu de la « feuille de calcul global » et en sélectionnant « renommer ». Développez le spécimen en cliquant sur le signe (+) signe, puis double-cliquez sur l’icône de tube, faites un clic droit dessus, et encore une fois sélectionnez « Renommer » pour décrire l’échantillon. Utiliser ce graphique de terrain dot avec défaut SSC-A vs FSC-A d’exécuter un échantillon de contrôle négatif dans du PBS seul en double cliquant sur ce tube ou en sélectionnant la flèche à côté de lui. Juste avant d’exécuter l’exemple, resuspendre le culot dans 500 µL glace froide FACS exécutant tampon et échantillon de transfert à un FACS tube (voir table des matières), mélange bien de pipetage et effleurant le tube. Placer les cellules remises en suspension sur le tube d’injection échantillon (SIT) de l’instrument. Presse « acquérir de données » avec « Événements à afficher » 30 000-50 000 et les « Événements de Record », 10 000, débit faible (Démarrer ; augmenter si nécessaire) et « Affleurer » sélectionné.Remarque : La vitesse appropriée (faible, moyenne ou haute) est la vitesse à laquelle le nombre d’événements/s est approximativement entre 200 et 2000. Utilisez cette gamme pour toutes les étapes. Tout en acquérant, ajuster le seuil de tension photomultiplicateur (PMT) de tube si nécessaire en sélectionnant l’onglet « Seuil » sur et changer la « valeur ». Régler la tension de diffusion vers l’avant et latérale (FSC et SSC) telles que les cellules de contrôle négatif dans du PBS seul tombent légèrement au-dessous du centre.Remarque : Les paramètres supplémentaires (par exemple, SSC) peuvent être ajoutés dans l’onglet « Seuil » à l’aide de l’icône « Ajouter ». Généralement, les tensions PMT d’environ 700 V à 1000 v pour les SSC et FSC fonctionnent bien pour e. coli. Si l’échantillon est lu correctement, régler le débit pour afficher les événements de 200-2000/s et appuyez sur « Données d’enregistrement ». Lorsque vous avez terminé d’enregistrement, retirez le tube du SIT et placez sur la glace. Cliquez sur l’icône « Polygone Gate » et utiliser la souris pour dessiner un portail autour de la majorité de la population cellulaire dans le nuage de points. Faites un clic droit sur parcelle de dot et sélectionnez « Afficher la Population hiérarchie ». Utiliser cette porte « P1 » en tant que parent en cliquant sur « P1 » dans la hiérarchie de la population. Créer un nouveau terrain de dot suite étape 2.5. Cliquez avec le bouton droit sur chaque axe et modifier l’axe des ordonnées à la FITC-A et l’axe des abscisses à FSC-A. Porte le contrôle négatif (PBS seul) à l’aide de l’icône « porte de polygone », avec la porte aussi serrée que possible sur le côté supérieur et gauche de la population.NOTE : Vérifiez bien la hiérarchie de la population pour s’assurer que le portail de P1 est un parent de la porte de P2. Si ce n’est pas le cas, il apparaîtra en ligne avec la porte de P1 et « Tous les événements » sera le parent ; supprimer la porte et recréez-la après l’étape 2.10. Dans la population, sélectionnez « P2 », faites un clic droit et sélectionnez « inverser la porte ». Faites un clic droit sur l’intrigue de dot avec porte de P2 et sélectionnez « Afficher les Populations ». Sélectionnez les populations « P2 » et « Pas P2 » pour l’affichage (moins de 1 % de la population devrait tomber à l’extérieur de la porte). L’intrigue dot avec P2 porte un clic droit et sélectionnez « Create Statistics View ». Faites un clic droit de la fenêtre d’affichage des statistiques et sélectionnez « Modifier statistiques View ». Cliquez sur l’onglet « Populations » et d’ajouter ou de supprimer des populations, comme vous le souhaitez, y compris la population parente, P1 (P2 et P2 pas devraient déjà montré). Cliquez sur l’onglet « Statistiques » et ajouter « FITC-A médiane » et toutes les autres statistiques d’intérêt. Fermez la fenêtre en appuyant sur OK. Créer un graphique de plot point semblable pour PE-A vs FSC-A et porte à l’aide de PBS seul échantillon (parcelles précédentes peuvent être dupliqués et modifiés). Utilisez cette feuille de calcul pour exécuter tous les exemples (y compris les cellules de contrôle négatif incubées avec chaque cible marquée fluorophore) de cette façon, environ 10 000 événements d’enregistrement pour chaque.Remarque : Les cellules qui tombent en dehors de la porte après l’incubation avec la protéine cible-488, le YPet positive control, etc. sont des liants à cette protéine, et la valeur de « Pas PX » (où X est le nombre de la population fermée pour ce graphe) doit être comptabilisée comme % lié. Lorsque vous utilisez SAPE comme témoin négatif, utilisez l’intrigue de FSC-A PE-A vs. L’intensité de la fluorescence médian (IFM) de P1 doit également être enregistrée car cela donne des informations au-delà de liaison %, pour montrer le degré de liaison en termes relatifs et est plus robuste en présence de valeurs aberrantes, 45. Intensité de la fluorescence médian peut être normalisée (IFNM) en divisant les IMF de chaque peptide par l’IFM d’un contrôle seul point négatif de l’échafaud (avec aucun peptide N-terminal), ou un clone contenant une séquence peptidique qui ne lie pas la cible d’intérêt, après incubation avec la même cible, conjuguée à la même fluorophore 14. Si ces cellules contrôle négatif ne sont pas disponibles, les cellules non induits incubés avec la même cible et étiqueté par le fluorophore même permet également à la normalisation. 3. le séquençage des potentiels candidats et évaluation d’affinité Détermination de la séquence peptidique Sélectionnez et ordonnancer des dizaines ou des centaines de colonies bactériennes de la tour (s) final de protéines (généralement rondes 3 et/ou 4 sont suffisamment 14). Analyser la séquence de données à l’aide du fichier de macro que nous avons développée (voir information justificative pour le code, « Sub eCPX_Sequencing ») à précisément analysent les séquences produits des protéines, la bibliothèque d’affichage bactériennes 15mer répertoriée dans le tableau de matériaux. Utilisez le logiciel de feuille de calcul répertorié dans le tableau des matériaux ou d’autres logiciels compatibles préféré.Remarque : Un certain nombre d’outils est disponible en ligne qui peuvent aussi aider à l’ADN séquence analyse 47. Si vous préférez, utiliser une autre méthode établie pour l’analyse des séquences et passez à l’étape 3.1.3. Télécharger l’ensemble des fichiers de séquence (.seq fichiers, documents de texte fonctionnent également) et de les extraire dans un nouveau dossier. Si nécessaire, déplacez ou copiez le dossier sur le disque dur de l’ordinateur (par opposition à un dossier réseau) pour améliorer la vitesse. Ouvrez une nouvelle fenêtre de feuille de calcul. Assurez-vous d’activer les macros et activer toutes les fonctionnalités, si ces messages pop-up.NOTE : Étapes 3 à 6 ci-dessous devraient suffit à remplir la première fois, que la macro est utilisée. Pour une analyse ultérieure, tout simplement « exécuter une Macro » commençant à l’étape 7. Copiez tout le contenu de la macro dans le fichier « Sub eCPX_Sequencing ».Remarque : La version actuelle est mises en place avec l’accompagnement des séquences pour la bibliothèque de 15-mer répertoriées dans le tableau des matériaux et se traduira par les acides aminés entre eux. Des séquences supplémentaires peuvent être entrés en copiant 5′ accompagnement des séquences dans la colonne A et 3′ accompagnement des séquences dans la colonne B de la feuille de calcul, jusqu’à 10 séquences pour chacun, avant d’exécuter la macro. Dans le fichier de feuille de calcul vide, sélectionnez l’onglet « Affichage », puis double-cliquez sur « Macros ». Sélectionnez le dossier personal.xlb. Si ce n’est pas disponible, enregistrer une macro tout d’abord pour rendre cette convocation. Cliquez sur « créer » ou « pas dans », selon ce qui peuvent être mis en évidence. Collez l’ensemble macro dans le module. Cliquez sur Enregistrer icône ou allez dans fichier, enregistrer. Sortie du module. Si une fenêtre s’ouvre, appuyez sur OK. Exécutez la Macro : allez dans le dossier où se trouvent les fichiers desired.seq. Cliquez sur la barre à côté de l’icône du dossier en haut pour voir l’emplacement du dossier. Copiez-le. Aller à la nouvelle fenêtre de feuille de calcul. Sélectionnez l’onglet Affichage, puis double cliquez sur macros. Sélectionnez « eCPX_Sequencing » dans la liste, puis cliquez sur « Exécuter ». Dans la boîte qu’apparaît, collez l’emplacement du fichier copié à l’étape 7 et appuyez sur entrée. La macro devrait commencer en passant par les séquences et de les organiser dans des tables sur plusieurs feuilles. Utilisez la feuille « Tableau récapitulatif » pour déterminer s’il sera nécessaire de vérifier les fichiers de trace pour trouver des erreurs et apporter des corrections manuellement (si séquences contient « X », ou ne pourraient pas être traduits).Remarque : Le tableau « sommaire » affiche les séquences peptidiques traduit, triées par ordre d’acide aminé (de A à Z), à moins qu’une erreur de séquençage a empêché traduction. Un « X » indique un acide aminé individuel qui ne peut être déterminé. Une fois que les séquences soient traduites, organisées, et corrigé les erreurs de séquençage, vérifiez la liste de séquence peptidique trié sur la feuille « Tableau récapitulatif » pour toutes les séquences répétées. Cultiver des cultures durant la nuit des colonies séquencée d’intérêt (y compris les répétitions et/ou des peptides avec des tendances perceptibles au minimum) dans 5 mL LB Cm25 à 37 ° C, secouant à 225 t/mn et enregistrez les stocks congélateur le lendemain dans LB contenant 15 % de glycérol, comme à l’étape 1.4.7. tester les peptides avec répétition de séquences pour affinité et spécificité selon les méthodes de FACS décrites dans l’article 3.3 et utilise le format FASTA de la liste de séquence (liste complète et répète seulement) pour aligner les séquences à l’aide d’alignement préféré et programmes d’analyse, qu’à l’article 3.2. Alignement de séquences utilisant Clustal Omega, Kalign et des programmes similaires Copier des séquences au format FASTA de la feuille de calcul FASTA de la macro, ou sinon créer une liste de fichiers FASTA des séquences doivent être alignés (tels que ceux de l’étape 3.1.3).NOTE : Colonne A contient les fichiers FASTA dans l’ordre numérique par « Seq # » tandis que la colonne B affiche triées par « Séquence d’AA » de la feuille « Tableau récapitulatif ». La liste des séquences peptidiques triés par ordre d’acide aminé affichera des séquences inutilisables en haut, comme un vecteur vide (comme « # vide ») et ces séquences dans laquelle ni les critères de recherche 5′ ou 3′ ont été trouvés (comme « # valeur »). Cette fonctionnalité permet à simple mise à jour ou la suppression de ces séquences de l’analyse. Ouvrir Clustal Omega48 ou Kalign49 logiciel en allant sur le site 50,51, ou utiliser un autre logiciel préféré pour l’alignement de la séquence. Copiez et collez la liste de séquence FASTA et il entrer dans la zone ci-dessous « séquences dans n’importe quel format pris en charge ». Changer « peine ouvert de gap » à 30 sous « autres options » en Kalign (ce n’est pas possible en Clustal oméga), mais sinon, conservez les paramètres par défaut avant de cliquer sur « soumettre ». Analyser l’alignement de séquences à l’aide de Jalview 52,53 logiciel directement dans le logiciel en ligne Clustal Omega et Kalign en sélectionnant l’onglet « résultat analytique » au-dessus de l’alignement, puis en cliquant sur l’icône « Jalview ».Remarque : Si vous préférez, ou d’analyse des alignements de séquences générées par des programmes alternatifs, Télécharger 54 le logiciel séparément et copiez et collez l’alignement dans la fenêtre d’analyse, qui s’ouvre en cliquant sur « Fichier », « Alignement de l’entrée », et ” de la zone de texte ». Cela permet de déterminer facilement si une séquence consensus est présente dans l’alignement de la séquence d’entrée. En comparant l’affinité et spécificité à l’aide de FACS Inoculer 5 mL LB Cm25 additionné de 0,2 % p/v D-glucose avec chaque isolat individuel d’intérêt (au étape 3.1.4 et/ou aux colonies d’intérêt d’une analyse de la séquence dans la section 3.2, etc.) et un contrôle négatif approprié (affichage échafaudage uniquement ou un peptide qui ne lie pas la cible, tel que décrit dans la note d’étape 2.13). Cultiver une nuit à 37 ° C, secouant à 225 t/mn. Les cultures une nuit permet d’ensemencer 3 mL LB Cm25 avec 60 µl de cellules (01:50 dilution). Incuber à 37° C sous agitation à 225 tr/min, jusqu’à ce que la culture atteigne une OD600 de 0,5 – 0,55. Induire l’expression de peptide avec 0,04 % w/v L-arabinose plus 2 mM EDTA (pour la facilitation du peptide affichage 42), secouant à 225 tr/min pendant 45 min à 37 ° C. Place induit des cultures sur la glace. Pour chaque isolat, ajouter 5 cellules µL à 25 µL PBS seul ou PBS contenant : 150 nM YPet 12,13 (contrôle positif pour l’expression), le cas échéant ; 250 nM cible-488 ; 250 nM croisée ou des protéines-488 ; et 250 nM SAPE (voir 2.1 pour plus de détails). Incuber sur glace pendant 45 min. Cellules de centrifugeuse à 6 000 x g pendant 5 min à ta ou 4° C. Retirer délicatement le surnageant en dessinant le liquide du côté opposé de la pastille. Stocker les boulettes de cellule sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons et sont prêts pour l’analyse. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 500 µL glace froide FACS tampon, mélange bien de pipetage et effleurant le tube, juste avant la lecture à l’aide d’un cytomètre de flux (voir table des matières).NOTE : Voir l’étape 2.13 note pour plus d’explication du processus de blocage et de calcul des IFNM pour comparer la spécificité et l’affinité de liaison. Vous pouvez maintenant enlever non-liants ou liants non spécifique de l’analyse, et les liants d’affinité plus élevées doivent être réévaluées par alignement de séquence suivant l’article 3.2 de chercher plus loin les tendances qui ont été manquées dans le rapport initial séquencé population. Sections 3.2 et 3.3 peuvent être répétées au besoin comme les nouvelles tendances et des séquences consensus sont notés. Cette analyse peut inclure des séquences plus aléatoires si les tendances ne sont pas visibles.

Representative Results

Avec l’utilisation d’automatisé cellule magnétique activé tri (autoMCS) au lieu de tri cellulaire magnétique manuelle, fausses négatifs candidats sont considérablement réduits au cours des protéines bactériennes affichage bibliothèques 9,14. Étapes de tri négatifs peuvent être également être ajoutés selon les besoins pour réduire les liants non spécifique à la cible d’intérêt, et il est suggéré à tout le moins pour ajouter une sorte de négative contre le magnétique perles eux-mêmes à l’avant. Cette sélection négative contre les billes magnétiques eux-mêmes a été achevée avant quatre séries de protéines bactériennes choisis affichent la bibliothèque des classeurs de l’antigène protecteur (AP), comme illustré à la Figure 2et avant une sélection négative supplémentaire contre rivax et de quatre tours de sélection positive pour moslim, comme illustré à la Figure 3. Les perles utilisées ici sont conjugués de streptavidine pour la capture des protéines biotinylées, donc isolement involontaire de peptides liant à streptavidin lui-même est un souci et est contrôlée au moyen des FACS avec streptavidine-conjugué à la phycoérythrine (Figure 3 , SAPE). Au minimum, liaison streptavidine doit être testée pour des candidats individuels prometteurs lors de l’évaluation de liaison à la protéine cible. Le pourcentage obligatoire et IFNM pour SAPE devraient être faibles dans tous les tours de tri. Le degré de liaison de streptavidine peut augmenter légèrement avec chaque cycle de tri, comme dans la Figure 3, parce que la population est exposée à plusieurs reprises aux streptavidine des billes magnétiques après chaque tour de tri. Si le degré de liaison streptavidine fond devient problématique à l’analyse en aval, plus le tri négatif contre les billes magnétiques peut être effectuée après le tour de tri positif dans lequel la population de liaison streptavidine a augmenté en afin de réduire en aval préalable de faux positifs. Lorsque existent des protéines ou des matériaux qui pourraient gêner spécifiquement utilisation en aval du peptide pour une application spécifique, ou qui sont censés provoquer une réaction croisée avec des réactifs d’affinité pour la cible en raison de la construction et/ou la similarité de séquence, plus négatif tri contre cette protéine ou matériel est recommandé. C’est un exemple de tri négatif contre rivax avant isolation des peptides de liaison moslim, en raison de la similarité structurelle et l’homologie de séquence de ces deux protéines 1,15. Encore une fois, une réaction croisée liant aux protéines utilisées pour négatif étapes de tri peut être surveillé lors de l’analyse de tri des tours à l’aide de FACS (Figure 3Rivax-488). Dans le meilleur des cas, les IFNM et liaison pour cent sont faibles, comme dans cet exemple. Lorsqu’elle est disponible, un peptide de contrôle positif fixe, tels que le peptide P2X à l’extrémité C-terminale de l’échafaudage d’affichage produite par la bibliothèque d’affichage bactériennes utilisée dans les résultats représentatifs ici, peut aider à déterminer si le manque d’affinité avec le test de FACS est en raison de l’absence d’expression de l’affichage d’échafaudage elle-même, plutôt que de manque d’affinité de la sous-unitaires pour la cible. Dans la Figure 2 et la Figure 3, YPet Mona liant à cette P2X peptide est surveillé et montre que les premiers tours de tri expriment l’échafaud mal. C’est principalement en raison de la fréquence élevée des codons stop en peptides N-terminal Server dans la bibliothèque au hasard, ce qui signifie que l’échafaudage lui-même n’était pas produit. Autres effets peuvent en outre contribuer, comme la présence de peptides ayant des effets toxiques inattendus pour les e. coli, ou une diminution de croissance ou peptide affichage tarifs pour d’autres raisons (comme les mutations dans le génome bactérien). L’addition d’EDTA durant l’induction peut améliorer l’expression au cours de ces premiers tours de tri 42, mais n’a pas encore été testée. Liaison au YPet Mona dans chaque protéines population est considérablement améliorée par tour 3. Si l’on compare la Figure 2 , Figure3, il est clair aussi que le niveau d’expression peut être amélioré en augmentant le temps d’induction à 90 min (comme dans la Figure 2YPet Mona) au lieu de 45 min (comme dans la Figure 3YPet Mona), Bien que 45 min est généralement suffisante. Notez que l’IFNM pour YPet Mona est normalisé au niveau de la liaison YPet Mona des cellules contrôle négatif, donc valeurs près 1.0 sont typiques si le niveau d’expression est acceptable. Normalisant YPet Mona MFI à PBS seul IMF de l’échantillon même est également un moyen valable de comparer les niveaux de l’expression relative, mais donne des valeurs beaucoup plus élevées (comparer la Figure 2 et Figure 3 avec résulte de Sarkes et al. 2015, 15). Enrichissement de la bibliothèque pour les peptides de liaison à la cible spécifique d’intérêt est généralement obtenu dans les trois tours de tri positifs, mais continuant à un quatrième tour de tri peut être bénéfique, tel qu’illustré à la Figure 2 et Figure 3 . Ici, pour cent lié cellules et IFNM continuent d’augmenter de 3 tour à tour 4 pour les cibles de l’exemple, PA et moslim, qui est convertie (boxed) en rouge dans la Figure 2 et la Figure 3, respectivement. Les séquences de peptide affinité plus élevées peuvent être déjà présents en 3e mais sont susceptibles de l’enrichir davantage au 4ème tour, qui aide à la sélection de candidats potentiels 14. L’analyse des séquences de 4 ronds tend à révéler des séquences répétées et ce répéter des séquences sont un excellent point de départ pour affinité et spécificité analyse et détermination de la séquence. La macro eCPX_Sequencing fournie en complément de ce manuscrit contribue à rationaliser cette première analyse, comme illustré à la Figure 4. Commençant par un dossier de .seq ou des fichiers texte, la séquence d’ADN qui se trouve entre choisi 5′ et 3′ des séquences est traduit, organisée par la séquence d’acides aminés et analysé pour nombre de résidus d’acides aminés individuels dans chaque peptide. La liste triée des séquences de peptide isolé, tel qu’indiqué sur la capture d’écran feuille de tableau récapitulatif sur la Figure 4, permet de déterminer facilement les séquences répétées et à quelle fréquence. Les cellules de cette feuille de calcul contenant des séquences répétées sont décrites dans des couleurs différentes pour l’analyse plus facile. Il est recommandé de vérifier ces séquences répétées de séquences consensus et d’autres tendances. Ce climat est favorisé par le logiciel d’alignement de séquence comme Kalign et Clustal Omega, et l’analyse peut être effectuée sur la sortie de la séquence entière (y compris les séquences répétées et non répétitif à la fréquence de que leur apparition) et sur la liste des sélectionnés en bas de répéter des séquences (avec ou sans leur fréquence relative). Résultats représentatifs pour PA et moslim répétant des séquences, sans prendre de fréquence en compte, sont indiquées dans la Figure 5 a et 5 b, respectivement. Notez que dans la Figure 5 a pour l’objectif du PA, plusieurs des séquences répétées individuels eux-mêmes contiennent la séquence consensus WFCFTC (ou une séquence similaire), soulignée en rouge, qui a été déterminée en appliquant Jalview des logiciels d’analyse d’un Kalign alignement de séquences des séquences répétées. Ce consensus, comme WXCFTC, était précédemment déterminé à être un consensus de liaison PA, qui donne confiance dans la méthode de tri 9. Dans la Figure 5 b, où les séquences répétées pour la cible de moslim ont été analysées de la même manière, le résultat était très différent. Tout d’abord, il y avait seulement cinq séquences qui répète au 4ème tour de criblage pour des liants de moslim, plutôt que les quinze séquences répétitifs isolés de 4 ronds de criblage pour les liants PA (bien que 44 % plus colonies ont également séquencés pour PA). Deuxièmement, aucun des cinq séquences répétées contenait la séquence plus prometteuse de « consensus » (FWAWF, souligné en violet), bien que candidat AX-A15 contenait la séquence qui le mieux assorti (FWDTWF). Une analyse plus approfondie, y compris la liaison affinité et spécificité détermination, aidée à fournir le consensus des FWDTWF déterminée par les cinq meilleurs candidats pour la liaison de moslim dans la Figure 5, tel qu’expliqué ci-dessous. Une colonie représentatif de chaque séquence à répétition peut être analysée plus sur cellules affinité et spécificité à l’aide de FACS, comme dans la Figure 6 a pour les séquences répétées de protéines, de peptides de liaison moslim. Ici, il est clair que tous les cinq séquences répétées ont une affinité plus élevée pour moslim, le but visé, que rivax, la protéine structurellement similaire utilisée pour le tri négatif ou streptavidine placés en aval, qui est présent pendant le tri à cause des billes magnétiques utilisés pour criblage. Cela concorde avec les résultats déjà prometteurs pour affinité et spécificité des tours tris illustré à la Figure 3, où il est clair que l’enrichissement pour la liaison à la cible visée, moslim, augmente à chaque tour de protéines tout en affinité pour la protéine similaire, rivax, n’est pas. Toutefois, une séquence consensus satisfaisante n’était pas déterminée pour du tri moslim qui utilise la répétition de séquences chez le seul tour 4 (Figure 5 b et surtout la discussion). Retour aux 100 colonies séquencées du 4ème tour, cependant, il a été noté par oeil lorsque vous cherchez des séquences semblables à la meilleure correspondance pour le consensus prédit qu’un candidat supplémentaire, AX-A12, contenue la séquence FWDTWF qui a été notée dans isoler AX-A15 , et qu’un autre candidat, AX-A14, contenait une semblable de la séquence, DWNTWF. Ces et autres séquences qui contenaient des similitudes avec les séquences répétées, a montré des similitudes avec d’autres séquences non répétitif ou ont été choisis au hasard, ont été analysés par FACS pour affinité et une spécificité de liaison. Ceux testés sont classés en Sarkes al 2016 1 et les 5 liants Albums de cette analyse sont affichés dans la Figure 6 b, avec la séquence consensus établie que FWDTWF, illustré à la Figure 5. Une analyse similaire de l’affinité pour répéter des séquences peptidiques dans le 4ème tour de criblage pour les peptides qui reconnaissent la cible PA a révélé que les meilleurs liants, classées par le rapport entre les PA-488 nMFI:SAPE IFNM, contenaient le consensus WXCFTC ou similaire séquence (tableau 1). Avec ce rapport, les séquences organise entre ceux qui contenait le consensus et ceux qui n’ont pas. Les meilleurs candidats, contenant toutes les séquences reliées au consensus, ont été analysés de la même façon aux méthodes décrites ci-dessus pour moslim dans la Figure 6, telle que présentée dans Sarkes al 2015 14. Ces résultats démontrent que pour certaines cibles, analyse des peptides avec répétition de séquences peut-être suffire pour obtenir des liants avec affinité significative et spécificité pour une cible choisie et à déterminer une séquence consensus qui peut être, en soi, suffisante pour la liaison. Notez, cependant, que le nombre de répétitions ne reflète pas nécessairement l’affinité relative pour la cible d’intérêt (tableau 1). Lorsque l’analyse de répéter les séquences seuls ne suffit pas à déterminer un motif, il est utile d’alterner entre le séquençage et l’analyse de liaison pour affiner l’ensemble des candidats et de réexaminer les tendances parmi les candidats avec une affinité plus élevée . Même si on observe une tendance d’analyser les séquences répétées seuls, séquences supplémentaires non répétitif peuvent démontrer les mêmes tendances, ou autres tendances, à la poursuite de l’enquête. Figure 1 : schéma du protocole de protéines bactériennes affichage bibliothèques. Tel qu’illustré ici, bibliothèques d’affichage bactérienne de protéines est un processus cyclique. Chaque cellule dans la bibliothèque d’affichage bactérienne (voir table des matières) contient l’ADN plasmidique qui est maintenu tant que les cellules sont cultivées en présence de l’antibiotique pour lesquels le plasmide contient un gène de résistance (choloramphenicol dans ce cas). Chaque plasmide encode également la protéine d’échafaudage affichage qui expose un peptide aléatoire à l’extérieur de la cellule. Étant donné que chaque cellule doit contenir uniquement une séquence d’ADN de plasmide, chaque cellule doit afficher uniquement un seul peptide, dans de multiples endroits tout au long de la membrane cellulaire. Selon le niveau de la diversité de la bibliothèque au début de criblage et après chaque tour de tri, la séquence d’ADN peut ou peut ne pas être unique de cellule en cellule. Protéines commence avec la croissance et l’induction de la bibliothèque de la cellule pour afficher les différents peptides sur leur membrane externe. Ces peptides peuvent ensuite interagir avec une protéine cible (qui est biotinylated ou autrement marquées pour la capture). Pour cellule magnétique activé tri (MCS), protéine non lié est éliminé et les cellules sont incubées avec des billes magnétiques qui sont recouverts d’une protéine de capture (streptavidine dans cet exemple, qui a une forte interaction avec la biotine). La culture entière est alors exposée à un aimant pour séparer les cellules liées de cellules non liés. À l’aide d’un dispositif automatisé de tri magnétique est préféré pour la séparation des cellules réduire les faux positifs. Illustré ici est une sorte de positive, dans lequel les cellules qui sont liés à et éluer conjointement avec les billes magnétiques sont conservés. Pour une sorte de négative, qui nous effectuons habituellement à l’avant, le processus est le même, sauf que les cellules qui sont lavés hors de billes magnétiques sont conservés à la place. La fraction de la bibliothèque d’intérêt, lié (tri positif) ou indépendant (tri négatif), est cultivé du jour au lendemain et utilisé dans le prochain cycle de tri. Chaque ronde subséquente des protéines positif exige une diminution de volume cible de concentration et de perle pour améliorer la rigueur. Après chaque tour de criblage, affinité et spécificité des peptides pour la cible de protéine sont évaluées à l’aide de cellule activée par fluorescence triant (FACS) pour aider à déterminer quand arrêter de criblage et de commencer à enquêter sur des candidats individuels. Au besoin, séquençage de l’ADN et l’analyse de la séquence peptidique sont effectuées. Ces étapes de l’analyse peuvent être en soi un processus cyclique, particulièrement pour révéler les tendances chez les isolats individuels après la finale de criblage. À ce stade, tendances de séquence peptidique et/ou un consensus sont corrélé avec liaison affinité et spécificité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : exemple données pour l’analyse de FACS de tri séries : cible PA. Affinité déterminée par FACS est indiquée après 4 tours de criblage (tri positif) les bactéries choisi afficher la bibliothèque de peptides de liaison à la cible, l’antigène protecteur (AP). Cela a été effectuée après accomplir d’abord une sorte de négative contre les streptavidine des billes magnétiques. Pour l’évaluation de la liaison, les cellules ont été induites avec 0,4 % L-arabinose pendant 90 min avant l’incubation avec des solutions cibles et le contrôle et l’analyse de FACS. Analyse d’affinité pour la cible de liaison est convertie (boxed) en rouge. Montré ici sont les diagrammes de dispersion du FITC-A vs FSC-A et des valeurs pour les cellules pourcentage liés (par comparaison avec le témoin négatif gated incubé avec du PBS seul) et normalisée d’intensité de fluorescence médian (IFNM, par rapport au témoin exempt de peptide négatif incubé avec la même protéine marquée fluorophore) des cellules induites qui ont été incubées pendant 45 min avec : PBS de tampon seul, 150 nM YPet Mona (contrôle positif pour l’expression de peptide) ou 250 nM PA-488 (étiqueté cible). Notez l’enrichissement croissant en affinité pour la cible d’intérêt après chaque tour de criblage. Contrairement à la Figure 3, toutes les séparations de cellules autoMCS ont été réalisées à l’aide du programme Posselds. Partie de ces données peut également être visualisée dans les diagrammes de dispersion du FITC-H vs FSC-H dans Sarkes al 2015 14 pour la comparaison à la FITC-A vs parcelles FSC-A montré ici. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : données d’exemple pour l’analyse des FACS de tri séries : cible de moslim. Similaire à la Figure 2, montrée ici est comparative affinité pour une expérience complète de protéines, tel que déterminé par les FACS. La bibliothèque d’affichage bactérienne a été soumise à un tri négatif contre les streptavidine billes magnétiques, comme illustré à la Figure 2, mais a été ensuite soumise à un cycle supplémentaire de tri négatif contre une protéine homologue ayant une structure similaire et fonction, rivax, avant d’effectuer 4 tours de criblage positive pour les peptides de liaison à la cible visée, moslim. Pour l’évaluation de la liaison, les cellules ont été induites avec 0,4 % L-arabinose pendant 45 min avant la liaison à la cible, contrôle positif et témoins négatifs et de la lecture sur les FACS. Affinité pour le but visé est convertie (boxed) en rouge. Montré ici sont les diagrammes de dispersion du FITC-A vs FSC-A (ou PE-A vs FSC-A dans le cas de SAPE) et les valeurs de pourcentage cellules liées (par comparaison avec le témoin négatif gated incubé avec du PBS seul) et IFNM d’induite par les cellules qui ont été incubées pendant 45 min avec : PBS tampon seul, 150 nM YPet Mona (contrôle positif pour l’expression de peptide), 250 nM moslim-488 (cible de protéines marquées), 250 nM Rivax-488 (étiqueté cible potentielle des protéines une réaction croisée) ou 250 nM SAPE (témoin négatif pour une liaison directe à streptavidine billes magnétiques). Notez l’enrichissement croissant en affinité pour la cible d’intérêt, moslim, après chaque tour de protéines et un minimum affinité pour la protéine de structure similaire, rivax. Contrairement à la Figure 2, positive protéines 1er tour a été réalisée à l’aide des autoMCS Posselds programme tandis que tri rondes subséquentes ont été achevés en utilisant le programme Posseld, comme l’a proposé pour les protéines dans ce manuscrit. Ces données peuvent également être visualisées dans les diagrammes de dispersion du FITC-H vs FSC-H dans Sarkes al 2016 15 pour la comparaison à la FITC-A vs parcelles FSC-A montré ici. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : analyse de la séquence exemple de sortie à l’aide de la macro « eCPX_Sequencing ». Montré est une capture d’écran de 48 colonies séquencées de 4 ronds de criblage la bibliothèque choisi affichage bactérienne pour les liants de PA à l’aide de la méthode Posselds. La feuille « Tableau récapitulatif » est montrée ici. Notez que les colonies ont été numérotés dans l’ordre alphabétique de leur nom de fichier donné durant le processus de séquencement et que les zones entourant les séquences qui se répètent au moins une fois sont présentées dans des couleurs différentes pour l’analyse de données plus facile. La macro eCPX_Sequencing est fournie dans un fichier de code supplémentaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : détermination de l’alignement et le consensus pour deux protéines distinctes cibles de séquence. Toutes les images présentées ici ont été produites à Jalview logiciel avec la coloration après avoir aligné les séquences à l’aide de logiciels en ligne analyse Kalign 51Clustal_X. A) l’alignement de répéter les séquences de protéines PA rond 4 (correspond au tableau 1). B) alignement de répéter les séquences de protéines moslim ronde 4 (correspond à la Figure 6 a). C) alignement des 5 candidats de criblage de moslim ronde 4, tel que déterminé par l’analyse de FACS des candidats individuels (correspond à la Figure 6 b). La ligne rouge souligne la séquence consensus en A et C, alors que la ligne violette b souligne le précurseur de la séquence consensus déterminé pour moslim obligatoire lors de l’examen des séquences répétées seulement, soulignant le potentiel de besoin de tester l’affinité de liaison à l’aide de FACS avant un consensus peut être déterminé dans certains cas. Alignements semblables générés avec les logiciels d’analyse différent peuvent être vu dans Sarkes al 2015 14 et Sarkes al 2016 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : exemple liaison affinité et spécificité pour les candidats individuels analysés à l’aide de FACS. L’intensité de fluorescence médian normalisé (IFNM) déterminée au moyen des FACS pour séquences A) extensible et B) les 5 premiers candidats, tel que déterminé par affinité comparative pour la cible, moslim, du 4ème tour de criblage est présentée ici. Les données représentent la moyenne (barres) et la déviation standard (barres d’erreur) de trois expériences indépendantes de répliquer. Notez que tous les candidats indiqués sont assez précises pour moslim (barres de moslim-488, vertes) sur une protéine de structure similaire, rivax (barres de Rivax-488, rouges) et le contrôle négatif de streptavidine (SAPE, barres noires). Bien que deux des séquences répétées dans un (07-AX et AX-15) étaient aussi parmi les candidats de top 5 en B, la comparaison des résultats en A et B montrent que l’analyse de répéter les séquences seul ne suffisent pas pour isoler les peptides d’affinité plus élevées. Données présentées ici sont une adaptation de Sarkes al 2016 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Tableau 1 : taux de fixation spécifique aux liaisons non spécifiques pour les candidats individuels de répéter. Dans cet exemple, le nombre de séquences répétées et le ratio de PA (cible) IFNM à IFNM SAPE (témoin négatif) sont indiqués pour les séquences de candidat extensible de criblage PA tour 4. Ces données a été triées par rapport relatif de l’IFNM du nMFI:SAPE PA et analysées pour la présence de consensus WXCFTC connu, ou une séquence similaire, ce qui est indiquée en caractères gras et soulignée. Notez que les séquences s’auto-organiser tel que les candidats avec le consensus ont le plus haut ratio d’IFNM nMFI:SAPE de PA et donc interagissent plus précisément avec la cible. Les résultats affichés proviennent d’une seule expérience de FACS. Peptides ayant une affinité plus faible pour la cible ont été exclus les répétitions supplémentaires et d’analyse qui ont été publiés dans Sarkes al 2015 14. Suppplemental fichier 1 : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Suppplemental fichier 2 : S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Protéines bactériennes affichage bibliothèques a été une approche réussie à l’isolement des réactifs d’affinité, et peptides offrent une alternative intéressante aux anticorps de reconnaissance lorsque des critères spécifiques sont nécessaires, comme la stabilité dans des environnements extrêmes. Criblage de ces bibliothèques a été simplifié à l’aide des méthodes autoMCS décrites ici, et une plate-forme d’autoMCS disponible dans le commerce s’étend cette technologie à un plus large public. Par rapport aux traditionnels alternant MCS/FACS des méthodes de tri pour bactérien affichent les bibliothèques, les méthodes autoMCS sont moins chers car ils ne nécessitent pas d’investissement dans un instrument de FACS plus cher capable de trier et isoler les cellules liées, plutôt que le type du cytomètre de flux qui est utilisé ici, qui est seulement capable d’analyse ¹⁴. Les étapes critiques de criblage réussi par autoMCS incluent sélection de programme de séparation, négative tri contre Croix-réactifs possibles pour réduire les faux positifs, enrichissement de la bibliothèque par FACS pour déterminer quand arrêter de protéines, de surveillance et analyse intelligente de la piscine de candidat afin d’éviter la lourdeur dépistage des centaines de candidats.

Les exemples décrits dans les présentes démontrent des protéines réussie de la bibliothèque choisie affichage bactérienne pour deux cibles distinctes, PA et moslim, mais avec des stratégies d’analyse légèrement différente en raison de différences dans les séquences peptidiques pour chaque pool de candidats après quatre tours de criblage. PA a été le cas plus simple, avec analyse des séquences montrant des tendances claires des séquences peptidiques qui répète au moins une fois dans 144 colonies. Cela seul a été suffisante pour déterminer une séquence consensus pour la cible de PA et les colonies qui contenait le consensus ou une séquence similaire ont été les meilleurs candidats en ce qui concerne le taux de liaison aux PA par rapport à la liaison au contrôle négatif streptavidine. Cependant, ce ne sera toujours le cas. Pour la cible de moslim, séquençage 100 colonies poussèrent à cinq séquences répétées, mais la tendance dans ces séquences était moins claire, autre qu’une tendance à contenir des résidus d’acides aminés aromatiques et de l’acide aspartique ou de l’asparagine. Le « consensus » prédit des séquences répétées seulement pourrait ont été produit et testé pour affinité à moslim, mais comme aucune séquence parent ne contenait cette séquence exacte, nous revient à la liste des colonies séquencées et observé que d’autres candidats qui ont des tendances plus en commun avec l’autre. En fait, deux colonies contenaient une séquence similaire au « consensus » entre les seules, répétitions (FWDTWF au lieu de FWAWF), qui avaient la même tendance, des résidus de tryptophane, phénylalanine et l’acide aspartique, mais avec un espacement différent. Un de ces peptides était une séquence à répétition, on n’était pas. Ces deux séquences, ainsi qu’une troisième séquence contenant une variante similaire, ont été parmi les top 5 reliures testés en fonction de l’affinité de moslim. Le haut de la page liant ensemble, AX-A05, a également affiché des tendances similaires. Les résultats de moslim démontrent qu’une approche qui alterne plusieurs fois entre le séquençage et l’analyse affinité et spécificité seront parfois nécessaire, en fonction de la cible choisie. Les résultats pour la cible de moslim démontrent également le degré de spécificité qui peut être réalisé sur une protéine très similaire (rivax ¹^,,¹⁵).

Les programmes d’autoMCS choisis pour nos études étaient Posselds et Posseld, qui sont à la fois pour la sélection positive de cellules-cibles marquées avec basse fréquence, inférieure à 5 % de la population initiale. Dans les deux cas, les cellules passent par deux colonnes magnétiques. Dans le cas du programme Posselds, toutefois, les cellules passent plus lentement sous la première colonne pour augmenter l’exposition temps ⁴¹. Outre les descriptions de programme données par le fabricant de l’appareil autoMCS commercial (voir Table des matières) ⁴¹, ces programmes ont été choisis après une comparaison initiale de plusieurs programmes potentiels. Capacité de chaque programme d’éviter tirant de faux positifs d’une culture homogène de cellules de contrôle négatif et d’isoler avec succès un liant connu à une cible d’intérêt d’une culture mixte contenant des cellules de contrôle négatif dopés avec une diminution pourcentage du liant connu, ont été comparés. S’écartent considérablement les applications décrites ici, une comparaison similaire pourrait être utile dans la sélection du programme pour la nouvelle application. Cependant, déjà publié des résultats comparant ces deux programmes (Posseld et Posselds) pour l’isolation du peptide affinité réactifs pour PA a montré que l’utilisation ou l’autre de ces programmes pour quatre tours de criblage conduisait à l’isolement des peptides similaires affinité et spécificité pour PA et détermination du consensus WXCFTC. Les principales différences sont que Posseld, avec son débit rapide, tri plus rapidement et d’affinité pour la cible était donc plus élevé après seulement deux tours de protéines, tandis qu’à l’aide de Posselds conduit à des séquences uniques plus après quatre tours de protéines ¹⁴. leçons de cela, la stratégie a été modifiée légèrement lors de protéines, de peptides de liaison moslim à intégrer les deux avantages : Posselds a été utilisé pour le 1er tour afin de permettre des temps d’exposition plus au cours de cette étape cruciale où la diversité est plus élevée, mais ensuite le programme a été changé à Posseld pour l’isolement plus rapide des liants affinité plus élevées pendant les cycles 2-4 ¹^,¹⁵. Cela semble idéal pour moslim, surtout depuis l’IFNM et la liaison pour cent étaient toutes deux plus élevées de moslim 4ème tour contre PA tri tour 4 avec un programme de tri (Figure 2 et Figure 3 et Sarkes al 2015 ( ¹⁴), mais une comparaison directe à l’aide d’une stratégie par rapport à l’autre avec la même cible serait nécessaire pour une comparaison plus concluante. Quel programme est le mieux pour une application particulière peut dépendre de l’objectif individuel, la bibliothèque de tri utilisée et le niveau d’expression de peptide qui est obtenue avec un changement aux conditions décrites ici.

Ne pas discuté Voici les résultats potentiels de protéines avec des matériaux abiotiques, mais nous avons aussi utilisé la même bibliothèque affichage bactérienne pour criblage contre en bloc en aluminium ². Cette étude n’a été effectuée à l’aide d’autoMCS, mais des études similaires pourraient être accomplis à l’aide d’autoMCS si le matériel est disponible sur, ou pourrait être enduit ou conjugué à, une perle magnétique. Dans l’étude d’aluminium en vrac, des acides aminés individuels analyse et modélisation de la structure secondaire a été utile pour comprendre ce qui conduisait l’affinité des peptides isolés, puisqu’aucune séquence consensus a été déterminé ². Même avec des cibles biologiques, cela peut être nécessaire pour comprendre ce qui motive l’affinité de liaison pour certaines cibles, ce qui explique pourquoi la feuille générée à partir de la macro « eCPX_Sequencing » comporte un onglet avec analyse de fréquence des résidus individuels. Si aucune séquence répétitive n’est perçus en plus de l’absence d’un consensus, et fréquence des résidus ne montre aucune tendance, cependant, autres types d’analyse peuvent être requis. Plus, il peut être nécessaire pour éviter un beaucoup plus grand nombre de candidats pour la sélection de ceux qui ont une affinité suffisante à la cible souhaitée de dépistage de tri plus rondes.

Avec la disponibilité croissante de séquençage de la génération suivante, une étude plus approfondie peut être effectuée pour déterminer les candidats les plus prometteurs avant le test d’affinité et de déterminer l’étendue de l’enrichissement après chaque tour de criblage. Cependant, les séquences de passer à l’étape de l’analyse de liaison devrez peut-être être recréé par clonage, si elles ne sont pas de fréquence suffisamment élevée pour isoler facilement avec le séquençage systématique colonie de dizaines ou de centaines de colonies. Comme cette technologie progresse, devenant moins cher et plus systématique, et surtout avec une option pour l’isolement de la colonie, il va probablement être le meilleur moyen d’analyser les données de criblage. Il peut conduire à élucider les séquences de manière individuelles et l’intégralité de votre bibliothèque, évoluer. En outre, les bactéries présentes dans la bibliothèque de tri peuvent se transformer au fil du temps, ce qui pourrait biaiser tri vers les cellules avec plus rapide taux de croissance ou les bactéries qui surexpriment génomiques protéines capables de lier un matériau même sans affichage expression échafaudage et peptide, pour instance. Pour cette raison, une fois que les candidats prometteurs émergent, il vaut isoler l’ADN de plasmide, retransforming frais d’e. coli et confirmant une liaison peptidique via FACS. Si l’intention d’utiliser le peptide dans un format acellulaire, affinité devrait aussi être appréciée pour le peptide gratuit. Par exemple, les réactifs d’affinité peptide découverts par affichage bactérienne pour la cible de SEB ont été produites synthétiquement hors de la cellule et analysées par des méthodes plus traditionnelles telles que le dosage immunoenzymatique dosage immunoenzymatique (ELISA) et sur-cellule (via FACS) et hors de la cellule (par ELISA) affinité ont été comparés à l’aide de K_ds déterminé par les deux méthodes ⁷.

Bien que la force de l’interaction de la Streptavidine-biotine rend une stratégie idéale pour la capture de cible de protéines et de peptides liés, cette procédure peut être modifiée pour les autres stratégies de capture. Couplage direct de protéine à billes magnétiques, tels que l’époxy et des perles de l’acide carboxylique, a été un succès et supprime une étape de liaison. Cependant, fixation directe susceptibles de gêner les sites potentiels de liaison de manière spécifique ou non spécifique, selon la stratégie de l’attachement. Un avantage supplémentaire à l’utilisation de perles de streptavidine est que moins stable protéines cibles peuvent être fraîchement biotinylé en 30 min ou stockés congelés, si nécessaire, tandis que les perles eux-mêmes ont tendance à exiger plus de temps d’incubation avec la protéine de réticulation et sont généralement conservés à 2-8° C. La concentration de départ suggérée de protéines biotinylées cible ici, 600 nM, a été un succès pour plusieurs cibles, mais il peut être possible d’isoler des réactifs de capture de peptide avec une affinité accrue si cette concentration est réduite. En outre, cette méthode peut être étendue aux et modifiée pour les autres bibliothèques d’affichage bactérienne et d’autres organismes. Par exemple, ces étapes peuvent être effectuées en l’absence d’oxygène pour utilisation avec des bactéries anaérobies, ou dans d’autres environnements pour une utilisation avec les extrêmophiles pour isoler les peptides aux propriétés uniques. Les peptides et/ou le consensus établi pour une cible particulière d’intérêt peut être potentiellement utilisés sur cellules comme hors-cellule de vie matérielle, ou produites synthétiquement. Peptides synthétiquement produites peuvent être plus mûri pour le développement d’affinité encore plus élevée et plus robustes agents de protéines catalysées capter (PCC) pour utilisation dans les capteurs, ou pour d’autres applications où des anticorps est généralement utilisées pour la liaison ou reconnaissance de ³⁸^,⁵⁵. Modélisation moléculaire peut également servir pour aider à déterminer la force exécutoire emplacement du peptide avec sa cible, que s’est déroulée récemment pour les peptides de liaison de moslim et de consensus figurant dans la Figure 5 ¹. Globalement, les protéines bactériennes affichage bibliothèques pour réactifs affinité peptide est une alternative rapide, simple et puissante à la production d’anticorps pour la reconnaissance et la détection des protéines cibles et ce criblage semi-automatisé approche a produit des résultats fiables avec des applications de portée considérable.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à souligner l’appui de la programme de bourses postdoctorales US Army Research Laboratory (ARL), administrés par les universités de Oak Ridge Associated grâce à un contrat avec ARL, par le biais de la nomination du Dr Justin P. Jahnke. Reste du financement a été fourni par les capteurs et les électrons périphériques Direction des ARL. Les auteurs tiennent également à remercier le laboratoire Daugherty UCSB pour partager l’écran bactérienne Bibliothèque et information pour le réactif de YPet Mona, Dr. Bryn Adams pour soutien à cloner le réactif de YPet Mona à ARL, Dr. Joshua Kogot pour ses premiers travaux sur le clonage et formation au criblage de bibliothèques d’affichage bactérienne, Alena calme d’Edgewood chimiques et biologiques Center pour le partage des plasmides utilisés pour exprimer et purifier moslim et protéines rivax, Brandi Dorsey pour le support technique pour l’isolation des peptides de liaison PA, Qin Guo pour le support technique des expériences préliminaires pour l’isolement des peptides de liaison de moslim et Dr Jessica Terrell pour discussions utiles au sujet de ce manuscrit.

Materials

autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545	Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB)	Fisher Scientific	BP1426-500	Growth medium
Chloramphenicol	Fisher BioReagents	BP904-100	Antibiotic
Agar	Fisher Scientific	BP2641-500	Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library	Cytomx Therapeutics	N/A; http://cytomx.com/contact/	On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose	Sigma	A3256-500G	Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)	Amresco	0780-10L	Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh	Thermo Scientific	PI21327	Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit	Thermo Scientific	PI28005	Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads	Invitrogen	65601	Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9647-100G	Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose	Sigma	G8270-1KG	Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona	UCSB and ARL	N/A	Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester	Thermo Scientific	46403	For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)	Thermo Scientific	S866	Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow	Becton, Dickinson, and Company	342003	Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns	Miltenyi Biotech	130-021-101	For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	Miltenyi Biotech	130-091-221	For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution	Miltenyi Biotech	130-092-987	For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol	VWR	E505-4L	Decontamination of autoMACS
Glycerol	Sigma	G6279-1L	For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack	Miltenyi Biotec	130-092-952	For MACS Separation
BD FACSCanto II	Becton, Dickinson, and Company	744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview	For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software	Becton, Dickinson, and Company	659523	For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator	Thermo Scientific	A13346	Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing	Genewiz	N/A; https://www.genewiz.com/	DNA and Colony Sequencing Services
Excel	Microsoft	323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400	For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA)	List Biological Laboratories, Inc.	171	Target protein used as example for representative results.
Abrax	ECBC and ARL	N/A	Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax	ECBC and ARL	N/A	Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

Referencias

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Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

Semi-automatique de criblage de bibliothèques d’affichage bactérienne pour Peptide affinité réactif découverte et l’analyse d’isolats qui en résulte

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Divulgaciones

Acknowledgements

Materials

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