细菌显示文库的半自动化筛选肽亲和试剂的发现与分离结果分析

1. 使用 autoMCS 的筛选细菌显示库 注意: 此基于 autoMCS 的排序协议以前已被描述为14, 在本手稿的补充材料中可获得更详尽的 “新用户扩展协议”, 进一步详细说明, 包括对潜在修改.如果 autoMCS 设备无法进行排序, 请参阅 Sarkes et al. 2015 中的补充协议, 因为在该工作中还描述了手动排序协议14。此处提供的 autoMCS 协议已进一步适应, 包括对改进的特异性的附加负排序步骤1,15。此筛选协议的示意图如图 1所示。 负分选去除可能与磁珠交叉反应的粘合剂 接种500毫升的 Luria 汤米勒 (LB) 含有适当的抗生素与大约 1 x 1011细胞的不同细菌显示分拣库 (见材料表)。注: 此处使用的细菌显示肽库 (参见材料表) 包含大约 109-1011唯一成员8,12 , 并在 lb 中包含25µg/毫升氯霉素 (磅 Cm25)。本协议的其余部分将假定使用此库。 孵育在37° c 与摇晃在 225 RPM 直到文化到达 OD600 0.5-0.55。通过稀释4% 股 1:100, 在37° c 下晃动 225 RPM, 诱导肽表达与 0.04% w/v L 糖。 把诱导的文化放在冰上。离心机大约 2 x 1011细胞在 6000 x g 为 20 min 在4° c。轻轻旋转, 去除1.5 毫升 PBS 中的上清和重细胞。注: 用于大肠杆菌的 OD600 1.0 大约等于 1 x 109单元格/mL。注意: 不要涡流, 因为这可能溶解细胞;重用手或在≤ 225 RPM, 4 ° c 的短暂晃动。 将细胞转移到离心管, 在 RT 或4° c 的 6000 x g 处旋转5分钟。除去上清液。重1毫升磷酸缓冲盐水 (PBS) 中含有0.5% 牛血清白蛋白 (BSA) 的细胞颗粒;PBS-B)。 洗涤300µL 亲和包覆的珠子 (大约 3 x 109珠子, 看见材料表) 在1毫升 PBS B 和离心机为5分钟在≥5,000 x g (在 RT)。把管子放在一台顶部磁粉分离器上。小心地除去上清, 避免颗粒。 重在细胞中的珠子加上 PBS B 混合物上面准备。在一个旋转平台上孵育4° c, 在冰上放置样品45分钟。 打开 autoMCS 仪器初始化系统。黄金线使用制造商的运行和洗涤缓冲器 (见材料表) 选择 “现在洗” 在屏幕底部的 “分离” 菜单, 然后 “冲洗” 和 “运行”。 用 pbs-b 作为清洗缓冲器, 在接下来的步骤中运行缓冲, 以 pbs b 作为系统的质数。从上部导航栏中选择 “分离” 菜单, 然后选择 “立即清洗”。选择 “冲洗” 和 “运行”, 以新鲜的 PBS-b 的系统。 转移细胞和珠混合物从孵化步到15毫升锥形管。把这个管子放在样品槽里, 在正面和反面的选择槽中放上15毫升的锥形管, 预冷 (4 ° c) 机架 (见材料表)。在仪器平台上放置机架。 为机架上的每个样本分配一个分离程序 (最多可在一次运行中对5样本进行排序)。在每个样品和最后一个样品之间添加一个 “冲洗” 步骤。选择 “运行” 以启动单元格分离。选择 “确定” 以确认有足够的缓冲区可用。注: “Posselds” 分离程序适用于负排序和正排序1轮和 “Posseld” 是排序回合 2-4 的首选, 但这两个程序已成功地用于所有负面和积极的排序回合14 、15和其他程序对于特定应用程序可能会更好 (在讨论中进一步介绍)。 当程序完成时, 卸下机架并保留适当的分数。在这里, 对于一个负的排序, 保留负分数 (包含没有珠子的细胞)。在冰上的地方。 使用负排序分数的整体, 以接种1L 磅 Cm25与0.2% 瓦特/v d-葡萄糖。在37° c 的夜间生长, 晃动 225 RPM。 在关闭 autoMCS 仪器之前, 请将运行和洗涤缓冲器更改为制造商的运行和洗涤缓冲器 (参见材料表)。选择 “立即清洗”, 然后 “冲洗” 和 “运行”。完成后, 请确保净化线上有70% 乙醇, 然后按屏幕右上角的 “电源图标”, 然后选择 “是”。 当系统关闭完成 (瓶子将是紫色的), 关闭机器。 第二天, 使用隔夜文化, 使冷藏库的每瓶约 1 x 1011细胞在 LB 与15% 甘油。另外, 或者, 在下一步中使用此区域性: 附加的负排序 (1.2 节) 或第一轮正排序 (第1.3 节)。 负排序, 以消除粘合剂可能与其他利益目标的交叉反应注意: 如果不需要进一步的负排序, 则可以跳过1.2 节。在这种情况下, 请继续执行1.3 节。对任何不受欢迎的目标的剩余约束力可由外地资产管制局评估, 如2节: 分类的分区域分析。 对于针对特定蛋白质靶的负排序, 如具有潜在的类似蛋白质, 也可绑定到发现的多肽1,15, 重复增长和归纳步骤 1.1.1-1.1.3, 从冻结的库存开始亲和从步骤1.1.15 或隔夜文化从步骤 1.1.12 (使用 OD600估计和接种 1 x 1011单元格) 的库。 将细胞转移到离心管, 在 RT 或4° c 的 6000 x g 处旋转5分钟。除去上清液。重细胞颗粒在1毫升 PBS 含有 600 nM 化交叉反应蛋白靶。在4° c 的旋转平台上孵育45分钟。注: 600 nM 是一个建议的起始浓度, 这可以改变, 如果有注意到的好处。利用材料表中所建议的试剂, 可以达到和量化蛋白质靶的法。 同时, 洗涤100µL 亲和包覆的珠子 (大约 1 x 109珠) 在1毫升 PBS B 和离心机为 5 min 在≥ 5000 x g (在 RT)。将管放在一台台式磁性微粒分离器上, 小心地除去上清, 避免颗粒。 将靶向细胞在 6000 x g 离心5分钟 (RT 或4° c), 去除上清, 并重1毫升 PBS B 中的细胞颗粒。重珠在整个洗净的细胞量中都有一定的交叉反应蛋白靶。在旋转平台上孵育4° c 30 分钟。 将样品放在冰上, 完成 1.1.7-1.1.15 的步骤, 制作出合适的冷藏库。如果所有所需的负排序已实现, 则继续到1.3 节, 或者对另一潜在的交叉反应蛋白重复第1.2 节, 以负排序。 1轮正面排序注: 1 轮对特定蛋白质靶的正排序类似于对特定分类目标的负排序 (见 1.2), 但保留含珠的阳性分数。 接种500毫升的 LB Cm25与大约 1 x 1011细胞的不同细菌显示排序库已亲和耗尽和成长过夜 (从步骤 1.1.12) 或冻结 (从步骤 1.1.15) 和解冻冰, 或已进一步耗尽粘合剂到其他交叉反应蛋白靶点 (从步 1.2.5), 如所希望的。 孵育在37° c 与摇晃在 225 RPM 直到文化到达 OD600 0.5-0.55。通过稀释4% 股 1:100, 在37° c 下晃动 225 RPM, 诱导肽表达与 0.04% w/v L 糖。 把诱导的文化放在冰上。离心机大约 2 x 1011细胞在 6000 x g 为 20 min 在4° c。在1.5 毫升 PBS 中, 通过轻轻旋转 (手动或在≤ 225 RPM, 4 ° c 下轻微晃动) 去除上清和重细胞。 将细胞转移到离心管, 在 RT 或4° c 的 6000 x g 处旋转5分钟。除去上清液。 重细胞颗粒在1毫升 PBS 含有 600 nM 化蛋白目标的兴趣。在4° c 的旋转平台上孵育45分钟。注: 600 nM 是一个建议的起始浓度, 这可以改变, 如果有注意到的好处。利用材料表中所建议的试剂, 可以达到和量化蛋白质靶的法。 同时, 洗涤100µL 亲和包覆的珠子 (大约 1 x 109珠) 在1毫升 PBS B 和离心机为 5 min 在≥ 5000 x g (在 RT)。把管放在一台顶部的磁性微粒分离器上, 小心地除去上清, 避免颗粒。 当靶向的孵育完成后, 将靶向细胞在 6000 x g 处离心5分钟 (RT 或4° c), 去除任何未粘合的靶蛋白。去除上清液, 重1毫升的细胞颗粒。重珠在整个容积的洗涤细胞中一定要达到蛋白靶。在一个旋转平台上孵育4° c, 在冰上放置30分钟。 打开 autoMCS 仪器初始化系统。黄金线使用制造商的运行和洗涤缓冲器 (见材料表) 选择 “现在洗” 在屏幕底部的分离菜单, 然后 “冲洗” 和 “运行”。 用 pbs-b 作为清洗缓冲器, 在接下来的步骤中运行缓冲, 以 pbs b 作为系统的质数。从上导航栏中选择 “分离” 菜单, 然后选择 “立即清洗”。选择冲洗和运行, 以新鲜的 PBS-b 系统的黄金。 转移细胞和珠混合物从孵化步骤以上到一个15毫升锥形管, 冲洗管与一个额外的500µl 的 PBS-b 和汇集与样品洗涤。把这个管子放在样品槽里, 在正面和反面的选择槽中放上15毫升的锥形管, 预冷 (4 ° c) 机架 (见材料表)。在仪器平台上放置机架。 为机架上的每个样本分配一个分离程序 (最多可在一次运行中对5样本进行排序)。在每个样品和最后一个样品之间添加一个 “冲洗” 步骤。选择 “运行” 以启动单元格分离。选择 “确定” 或 “继续” 以确认有足够的缓冲区可用。注: “Posselds” 分离程序适用于负排序和正排序1轮和 “Posseld” 是排序回合 2-4 的首选, 但这两个程序已成功地用于所有负面和积极的排序回合14,15和其他程序对于特定应用程序可能会更好 (在讨论中进一步介绍)。 当程序完成时, 卸下机架并保留适当的分数。在这里, 积极的排序, 保持积极的分数 (包含细胞和珠子)。在冰上的地方。 在关闭 autoMCS 仪器之前, 请将运行和洗涤缓冲器更改为制造商的运行和洗涤缓冲器 (参见材料表)。选择 “立即清洗”, 然后 “冲洗” 和 “运行”。完成后, 请确保净化线上有70% 乙醇, 然后按屏幕右上角的 “电源图标”, 然后选择 “是”。 当系统关闭完成 (瓶子将是紫色的), 关闭机器。 使用阳性排序分数的整体, 接种1L 磅 Cm25与0.2% 瓦特/v d-葡萄糖。在37° c 的夜间生长, 晃动 225 RPM。 第二天, 使用隔夜文化, 使冷冻储存在 LB 含有15% 的甘油, 和/或继续积极排序轮2在1.4 节。 后续的正分类轮注意: 通常, 建议使用四排序圆, 但三排序轮通常足够14,15。在2节所述的对分类回合进行的资产管制分析中, 协助停止分类。目标和磁珠体积的浓度随其后的每一次正分类而减小。 使用隔夜文化从早先排序圆 (或一个冷冻的细胞存货从那圆), 接种 5 mL LB Cm25与100µl 细胞 (1:50 稀释)。在37° c 下孵育, 以 225 RPM 晃动, 直到培养达到 0.5-0.55 的 OD600 。 诱导多肽表达与 0.04% w/v L-糖, 震动在 225 RPM 45 分钟在37° c。在冰上放置诱导细胞。注: 这种诱导培养也可用于评估其起源于分类的结合亲和性和特异性, 如下文2节所述。 离心机 1 x 108细胞在 6000 x g 为 5 min 在 RT 或4° c。在50µL PBS 中去除上清和重细胞颗粒, 其中含有化前一轮排序所用的一半浓度的蛋白质目标 (因此 300 nm 为圆 2, 150 nm 为圆 3, 75 nm 为圆 4, 从我们的建议起始点)。在冰上孵育45分钟 (或在4° c 旋转平台)。 同时, 洗涤亲和包覆的珠子 (15 µL 为圆 2, 8 µL 为圆3和4µL 为圆 4) 在1毫升 PBS B 和离心机为 5 min 在≥ 5000 x g (在 RT)。将管放在一台台式磁性微粒分离器上, 小心地除去上清, 避免颗粒。重珠在50µL PBS-B。 在45分钟孵化与目标在步骤 1.4.3, 离心的细胞在 6000 x g 5 分钟在 RT 或4° c, 去除上清, 和重的细胞在50µL 洗涤珠从1.4.4。保持样品在冰和完整步骤 1.3.7-1.3.13 为积极的排序。 接种一个5毫升的 LB Cm 的文化25补充与0.2% 瓦特/v d-葡萄糖与整个积极的, 珠含分数从排序。 第二天, 使用隔夜文化, 使冷冻储存在 LB 含有15% 甘油和/或继续下积极排序轮, 返回到步骤1.4.1。注意: 使用1.4.2 中的诱导培养来评估下面2节中描述的结合亲和性和特异性, 可以帮助确定何时停止排序。如果行中的两个排序回合显示相似的绑定关系, 或稍后的圆显示对感兴趣的目标的绑定关联减少, 这是停止排序的理想地方。最后一轮后, 回到 1.4.1, 但停止在1.4.2。 2. 分类回合的外地资产管制分析 使用从步骤1.4.2 的诱导细胞, 为每一个排序轮, 或相同的文化, 添加5µL 诱导细胞到25µL 的每个准备的解决方案的约束力评估 (也见材料表): 单独 PBS;PBS 与150毫微米 YPet Mona (YPet 12,13; 正面控制为表示), 如果可利用;900 nm 蛋白靶共轭到荧光染料, 如胺反应染料与发射/激发在 493 nm⁄518 nm (Target-488);900 nM 交叉反应蛋白靶 (s) 用于标有相同荧光染料的负分选 (交叉反应 Protein-488);和 900 nM 亲和-R-藻 (SAPE)。在冰上孵育45分钟。注: 如果继续直接从步骤 1.4.2, 这一步将始终是完成后的第二天, 筛选为该轮已完成, 因为向下选择的图书馆是成长过夜, 然后继和诱导第二天。同样地, 也可以使用从冻结的分类轮股中种植和诱导的文化;在这种情况下, 所有的回合都可以在一次试验中进行测试和比较。 在 RT 或4° c 下离心 6000 x g 的细胞5分钟。清除上清液, 在冰上储存样品。注: 细胞颗粒可以储存在冰上, 直到所有样品都准备好进行分析。 打开该系统的仪器, 开启软件, 启动, 并校准仪器按照制造商的说明43,44。 在资产管理系统软件中, 单击 “管理员”, 然后单击所需的文件夹或创建一个 “新文件夹”。点击屏幕左上方的 “新实验” 图标。右键单击图标以 “重命名” 实验。在该实验中, 单击 “全局工作表”。 单击 “点图” 图标, 然后单击全局工作表电子表格以创建此散。点击点图本身, 然后选择屏幕左上方的 “检查器” 图标, 通过在打开的窗口中选择 “Y 轴” 和 “X 轴” 旁边的框来调整坐标轴以 biexponential 显示。单击 “x”, 关闭 biexponential 显示窗口。 通过单击屏幕左上方的图标并通过右键单击 “全局工作表” 下的标本图标并选择 “重命名” 来重命名标本, 从而创建 “新管道”。通过点击 (+) 的标志展开标本, 然后双击管图标, 右键点击它, 再次选择 “重命名” 来描述样品。 使用此点图形与默认 SSC-a vs FSC-一个运行一个负控制样本在 PBS 单独通过双击该管或选择它旁边的箭头。在运行样本前, 重500µL 冰冷的细胞团运行的缓冲和转移样本到一个外地资产管制局 (见材料表), 混合良好的移和弹管。将悬浮细胞放在仪器的样品注射管 (坐) 上。按 “获取数据” 与 “事件显示” 在 3万-5万和 “事件记录” 在 1万, 流速在低 (开始; 增加, 如果需要), 和 “坐冲洗” 选择。注: 适当的速度 (低, 中, 或高) 是速度的事件/秒的数量大约在200和2000之间。 对所有步骤使用此范围。 在获取时, 通过选择 “阈值” 选项卡, 调整光电倍增管 (PMT) 电压阈值. 点击并更改 “值”。调整向前和侧面散射 (FSC 和 SSC) 的电压, 使 PBS 中的负控制单元仅在中心下方略有下降。注意: 可以使用 “添加” 图标在 “阈值” 选项卡中添加附加参数 (如 SSC)。通常, SSC 和 FSC 的 PMT 电压大约为700伏到 1000V, 对于大肠杆菌很管用。 如果样本读取正确, 请调整流量以显示200-2000 事件/秒, 然后按 “记录数据”。录音完成后, 从坐在冰上的地方取下管子。 选择 “多边形门” 图标, 使用鼠标在散中的大多数单元格中绘制一个门。右击点图, 然后选择 “显示填充层次结构”。 通过在 “填充” 层次结构中单击 “P1”, 可以使用此 “P1” 门作为父级。在步骤2.5 之后创建一个新的点图。右键单击每个轴, 并将 Y 轴更改为 FITC a 和 X 轴到 FSC a。门的负控制 (PBS 单独) 使用 “多边形门” 图标, 与门尽可能紧周围的顶部和左侧的人口。注: 双检查人口层次结构, 确保 P1 门是 P2 门的父级。如果不是, 它将出现与 P1 门和 “所有事件” 将是父母;删除该门并在步骤2.10 之后重新创建它。 在填充层次结构中选择 “P2”, 右键单击, 然后选择 “反转门”。右击点图与 P2 门和选择 “显示人口”。选择 “P2” 和 “不 P2” 显示的人群 (少于1% 的人口应该落在门外)。 右键单击 P2 门的点图, 然后选择 “创建统计视图”。右键单击 “统计视图” 窗口, 然后选择 “编辑统计视图”。单击 “填充” 选项卡, 并按需要添加或移除填充, 包括父填充、P1 (P2, 而非 P2 应已显示)。点击 “统计” 选项卡并添加 “FITC-中位数” 和任何其他感兴趣的统计数据。按 “确定” 关闭窗口。 创建一个类似的点图的 PE-a vs FSC-和门使用 PBS 单独样本 (以前的地块可以复制和改变)。使用此电子表格可以运行所有示例 (包括与每个荧光标记的目标一起孵育的负控制单元), 以此方式记录每项的大约1万事件。注: Target-488 蛋白孵化后脱落的细胞, YPet 阳性对照等是该蛋白的粘合剂, 而 “非 PX” (其中 X 是该图的门控种群数) 的值应记录为%。当使用 SAPE 作为负控制, 使用 PE-a vs FSC-一个情节。P1 的中位荧光强度也应该被记录下来, 因为这提供了超过% 绑定的信息, 以相对的术语显示绑定的程度, 并且在异常值45存在时更健壮。中位荧光强度可以归一化 (nMFI), 通过将每种肽的多边基金会划分为一个仅为负控制的支架 (无 N 端肽), 或一个含有不束缚目标利益的肽序列的克隆, 在孵化后与相同的目标共轭到相同的荧光14。如果这些负控制单元不可用, uninduced 细胞与同一目标一起孵育, 并用相同的荧光标记, 也可用于正常化。 3. 潜在候选者的序列分析和结合亲和性评估 多肽序列测定 从筛选的最后一轮 (通常是圆3和/或 4) 中选择并排列数十或数百个细菌菌落. 使用我们开发的宏文件分析序列数据 (参见代码的支持信息 “子 eCPX_Sequencing”), 专门分析筛选中列出的15mer 细菌显示库中生成的序列。材料.使用材料表中列出的电子表格软件或其他首选兼容软件。注意: 许多工具在网上都可以使用, 这也有助于 DNA 序列分析47。如果首选, 则使用不同的已建立方法进行序列分析, 然后跳到步骤3.1.3。 下载一组序列文件 (. seq 文件, 文本文档也可以工作) 并将它们解压到一个新文件夹中。如有必要, 请将文件夹移动或复制到计算机的硬盘驱动器 (与网络文件夹相对) 以提高速度。 打开一个新的电子表格窗口。如果这些消息弹出, 请确保启用宏并启用所有功能。注意: 下面的步骤3-6 只需要在第一次使用宏时完成。对于后续分析, 只需从步骤7开始 “运行宏”。 复制在 “子 eCPX_Sequencing” 文件中找到的宏的全部内容。注: 目前的版本是建立与侧翼序列的 15-滨海图书馆列出的材料表, 并将翻译的氨基酸之间。在运行该宏之前, 可以通过在电子表格的 B 栏中复制5个侧翼序列, 在 a 列和3的侧翼序列中输入其他序列, 最多10序列。 在空白电子表格文件中, 选择 “查看” 选项卡, 然后双击 “宏”。选择个人. xlb 文件夹。如果此项不可用, 请先录制宏以使其显示。 根据可以高亮显示的内容, 单击 “创建” 或 “步入”。将整个宏粘贴到模块中。 单击保存图标或转到文件, 保存。退出模块。如果弹出窗口, 请按 “确定”。 运行宏: 转到所需的. seq 文件所在的文件夹。单击顶部文件夹图标旁边的栏, 查看文件夹位置。复制它。 转到新的电子表格窗口。选择 “视图” 选项卡, 然后双击 “宏”。从列表中选择 “eCPX_Sequencing”, 然后单击 “运行”。 在弹出的框中, 粘贴在步骤7中复制的文件位置并命中 enter。宏应该开始遍历序列, 并将它们组织到不同的表中。 使用 “汇总表” 表确定是否需要检查跟踪文件是否有错误并手动进行更正 (如果序列包含 “X” 或无法翻译)。注: “汇总表” 显示翻译的肽序列, 按氨基酸序列 (从 a 到 Z) 排序, 除非顺序错误阻止翻译。”X” 表示无法确定的单个氨基酸。 一旦序列被翻译, 组织, 并纠正任何顺序错误, 检查在 “摘要表” 表上的任何重复序列的排序肽序列列表。 在5毫升磅 Cm25 ° c 下, 以 225 RPM 晃动, 并在第二天以 lb 含15% 甘油保存冷冻库库存, 在一步1.4.7. 使用3.3 节所述的资产管制方案方法, 用重复序列测试多肽的结合亲和性和特异性, 并使用序列列表的 FASTA 格式 (仅限完整列表和重复) 来对序列使用首选对齐和分析程序, 如3.2 节。 使用 Clustal ω、Kalign 和类似程序的序列对齐 从宏的 FASTA 电子表格中复制 FASTA 格式的序列, 或者从要对齐的序列中创建一个 FASTA 文件的列表 (例如, 步骤3.1.3 中的那些)。注意: 列 a 按 “Seq #” 的数值顺序包含 FASTA 文件, 而 B 列按 “汇总表” 表中的 “AA 序列” 显示它们。按氨基酸序列排序的肽序列列表将在顶部显示不可用的序列, 如空向量 (如 “# 空”) 和未找到 5 “或 3” 搜索条件的序列 (如 “# 值”)。此功能允许从分析中轻松更新或删除这些序列。 打开 Clustal 欧米茄48或 Kalign49软件, 方法是访问网站50、51, 或使用其他首选软件进行序列对齐。复制并粘贴 FASTA 序列列表, 并将其输入 “任何受支持格式的序列” 下面的框中。在 Kalign 的 “更多选项” 下, 将 “缺口开放罚款” 更改为 30 (这在 Clustal 欧米茄中是不可能的), 但在单击 “提交” 之前保留默认设置。 使用 Jalview 52,53软件直接在 Clustal 欧米茄和 Kalign 在线软件中分析序列对齐方式, 方法是选择对齐方式上方的 “结果摘要” 选项卡, 然后单击 “Jalview” 图标。注意: 如果首选, 或用于分析其他程序生成的序列对齐方式, 请分别下载54软件, 然后将对齐方法复制并粘贴到分析窗口中, 单击 “文件”、”输入对齐” 和 “从文本框 “。这提供了一种方法来轻松确定输入序列对齐中是否存在协商一致序列。 使用外地资产管制法比较装订亲和性 接种5毫升 LB Cm25 , 并辅以 0.2% w/v D-葡萄糖与每一个单独的利益隔离 (从步骤3.1.4 和/或利益殖民地的进一步序列分析在3.2 节,等) 和适当的负控制 (显示仅限脚手架或不绑定目标的多肽, 如步骤2.13 的说明中所述)。在37° c 的夜间生长, 晃动 225 RPM。 使用隔夜文化接种3毫升 LB Cm25与60µl 细胞 (1:50 稀释)。在37° c 下孵育, 以 225 RPM 晃动, 直到培养达到 0.5-0.55 的 OD600 。诱导肽表达与 0.04% w/v L 糖加2毫米 EDTA (为促进肽显示42), 晃动在 225 RPM 为45分钟在37° c。 在冰上放置诱导的文化。对于每个隔离, 添加5µL 细胞到25µL pbs 单独或 pbs 包含: 150 nM YPet 12,13 (对表达式的正控制), 如果可用;250 nM Target-488;250 nM 交叉反应蛋白-488;和 250 nM SAPE (见2.1 更详细)。在冰上孵育45分钟。 在 RT 或4° c 下离心 6000 x g 的细胞5分钟。小心地从球团的另一侧提取液体。储存细胞颗粒在冰上, 直到所有样品和准备分析。 重每个细胞颗粒在500µL 冰冷的场内运行缓冲, 混合良好的移和弹管, 就在阅读使用流式细胞仪 (见材料表)。注: 请参见步骤2.13 说明, 以进一步解释浇口和 nMFI 的计算, 以比较结合亲和性和特异性。非粘结剂或非特定粘合剂现在可以从进一步的分析中移除, 而最高亲和粘合剂应在3.2 节之后按顺序对齐来重新评估, 以寻找在初始测序中可能遗漏的进一步趋势人口.3.2 和3.3 节可以在需要时重复, 因为新的趋势和共识序列被注意到。这种分析可以包括更多的随机序列, 如果没有看到趋势。