Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen

Microfluidic apparaten toegenomen toegang bieden tot precies gecontroleerde omgevingen, waarin dieren, zoals de nematode C. elegans, experimenteel gemanipuleerde¹kan worden. Deze studies omvatten gedrags testen, calcium beeldvorming studies, of zelfs zeefresten voor specifieke fenotypen, wat resulteert in meer exacte metingen van experimentele resultaten^{1,2,3,4, 5,6}. Microfluidics bieden kleinschalige vloeibare omstandigheden, waardoor gedetailleerde experimenten kunnen worden uitgevoerd tijdens het gebruik te maken van de minimale hoeveelheden van reagentia. Er is een constante productie van nieuwe microfluidic apparaat ontwerpen, en het gebruik van elk varieert, van arenas waarmee voor de natuurlijke sinusvormige motie van C. elegans in behavioral testen en neurale beeldvorming studies, val van apparaten die worden gebruikt in de neurale beeldvorming en olfactorische studies, naar apparaten waarmee voor high-throughput fenotypische analyse in genetische^{4,5,6,7 schermen}. Na de fabricage van een master mold, microfluidic apparaten zijn goedkoop te construeren-gegeven de herbruikbaarheid van de meester — en makkelijk te gebruiken, waardoor snelle gegevens generatie via high-throughput onderzoek. De fabricage van apparaten met behulp van polymeren zoals Polydimethylsiloxaan (PDMS) voorziet in de oprichting van nieuwe apparaten binnen uur.

Calcium imaging studies gebruik genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) uitgedrukt in de doelcellen te meten van de neurale dynamiek van deze cellen in real-time^8,9,10,11. Het transparante karakter van C. elegans zorgt voor de opname van de fluorescerende niveaus van deze eiwitten in levende dieren. Traditioneel GECIs is afhankelijk van de groen fluorescente proteïne (GFP)-op basis van sensor GFP-Calmoduline-M13 Peptide (GCaMP), hoewel het meer recente studies hebben deze sensoren voor betere signal-to-noise ratio’s en rood-verschoven excitatie profielen aangepast. Na de ontwikkeling van GCaMP3, eiwitten met deze specificaties zijn gevarieerd, met inbegrip van sensoren zoals GCaMP6s en GCaMP6f (langzame en snelle fluorescentie af-tarieven, respectievelijk), evenals RFP-Calmoduline-M13 Peptide (RCaMP), die heeft een rode-verschoven activering profiel. De combinatie van deze GECIs met C. elegans cel-specifieke gensequenties promotor kan target cellen van belang, met name de sensorische neuronen^{12,13,14,15 , 16}.

Terwijl het gebruiksgemak C. elegans in microfluidic studies blijkt, hebben bijna alle studies gericht op hermafrodieten. Ondanks de mannetjes slechts accounting voor 0.01-0,02% van de bevolking van wild type, onschatbaar bevindingen kunnen voortvloeien uit hun karakterisering. Terwijl de fysieke connectome van de hermafrodiete zenuwstelsel volledig in kaart voor decennia^{17 gebracht is}, nog de mannelijke connectome onvolledig, vooral in de hoofd regio van de dierlijke¹⁸. Het gebruik van calcium beeldvorming bij mannen zal bijdragen tot het genereren van een goed begrip van de mannelijke zenuwstelsel en de verschillen die zich tussen de twee geslachten voordoen. De kleinere omvang van C. elegans volwassen mannetjes voorkomt dat effectieve en betrouwbare vangst in de havens van de laden van traditionele olfactorische inrichtingen die zijn ontworpen voor grotere hermafrodieten. Om aan te pakken dit, een gewijzigde versie van de Chronis olfactorische Chip¹⁹ werd ontwikkeld met een smaller laden poort, een lagere hoogte van het kanaal, en draait in de worm laden poort (die draaien het dier), waardoor voor de visualisatie van bilaterale links/rechts neuronale paren. Dit ontwerp toelaat: (1) de effectieve overlapping van jonge volwassen mannetjes, (2) een betrouwbaarder oriëntatie van het dier voor de visualisatie van beide leden van bilaterale gepaarde neuronen, en (3) de precieze beeldvorming van neurale activiteit in mannelijke neuronen.

Steeds meer tonen studies aan dat C. elegans mannetjes anders dan hermafrodieten op een verscheidenheid van ascarosides (ascr), of nematode feromonen^{20,21,22,23 reageren ,24}. Daarom, ontwikkeling van een goed begrip van de neurale dynamiek en voorstellingen binnen de mannelijke connectome geworden zelfs meer relevant. Mannelijke C. elegans bevatten 87 geslacht-specifieke neuronen niet aanwezig in de hermafrodiete^25,26, wijzigen van de connectome in als-nog onbepaald manieren. Zijnde kundig voor beeld van deze unieke neurale dynamiek zal ons in staat stellen geslacht-specifieke reacties en neurale vertegenwoordigingen beter te begrijpen.

Dit protocol beschrijft het gebruik van een man-aangepast olfactorische chip voor de neurale beeldvorming van mannelijke C. elegans chemosensation. De Nociceptieve neuron die Ash op betrouwbare wijze op 1 M van glycerol in mannetjes, consistent met vorige hermafrodiete reageert bestudeert²⁷. Blootstelling aan ascarosides kan uitlokken reacties die variabele van dier op dier, waarvoor een groter aantal dieren worden getest. De reactie van de man-specifieke CEM neuronen eerder gebleken, via zowel elektrofysiologie en calcium imaging studies, inspelen op variabel ascaroside #3²³.