Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale
Summary
Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l’intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un’amministrazione periferica, una tantum.
Abstract
Vettori di virus adeno-associato (AAV) sono un reagente chiave nelle neuroscienze per cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR), optogenetica, cre-lox targeting, ecc. Lo scopo di questo manoscritto è di aiutare l’investigatore tentativo di trasferimento del gene espansiva del sistema nervoso centrale (SNC) nel ratto tramite iniezione della vena della coda di AAV. Espressione su vasta scala è rilevante per le condizioni con patologia diffusa, e un modello del ratto è significativo a causa della sua maggiore dimensione e fisiologiche somiglianze agli esseri umani rispetto ai topi. In questa applicazione di esempio, una trasduzione neuronale su vasta scala è usato per simulare una malattia neurodegenerativa che colpisce l’intero midollo spinale, sclerosi laterale amiotrofica (ALS). La trasduzione di CNS su vasta scala efficiente consente anche di fornire fattori di proteine terapeutiche in studi pre-clinici. Dopo un intervallo di espressione post-iniezione di parecchie settimane, vengono valutati gli effetti di trasduzione. Per un vettore di controllo della proteina fluorescente verde (GFP), l’importo di GFP nel cervelletto è stimato rapidamente e in modo affidabile da un programma di formazione immagine base. Per fenotipi di malattia motore che sono indotte da ALS relativi transactive risposta della proteina del DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43), i deficit sono segnati da rotarod e riflesso di fuga. Oltre alla modellazione di malattia e terapia genica, ci sono diverse applicazioni potenziali per la larga scala gene-targeting descritto qui. L’uso esteso di questo metodo sarà di aiuto nel velocizzare in neuroscienze e Neurogenetica di verifica delle ipotesi.
Introduction
Vettori ricombinanti virus adeno-associato (AAV) sono strumenti indispensabili per la ricerca di CNS perché sono così efficienti per trasdurre i neuroni in vivo. I vettori AAV sono molto versatili per studiare diversi transgeni e isoforme della proteina, diversi tessuti, ospitano diverse specie e diverse vie di somministrazione. Per esempio, AAV può essere somministrato a topi di una periferica, relativamente non-invasiva, l’iniezione endovenosa di trasdurre neuroni in tutto il sistema nervoso centrale come in primo luogo descritto in Foust et al e Duque et al. (vedere Giove carta da Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 questo approccio di consegna del gene viene utilizzato nei ratti per esprimere in modo efficiente una proteina fluorescente verde (GFP) o l’ALS ha collegato la proteina, transactive risposta DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43) nel SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 lavorando in ratti è significativo perché i parametri fisiologici e metabolici del ratto sono più vicini agli esseri umani rispetto ai topi e ci sono le analisi tossicologiche e comportamentali progettate specificamente per i ratti. Inoltre, altre linee di ratto transgenico stanno diventando disponibili che possono essere utilizzati in studi di trasferimento del gene AAV.
Metodi sono dettagliate per il trasferimento del gene CNS espansiva nel ratto e quantificazione rapida, affidabile dei risultati. Trasduzione CNS su vasta scala è usato per imitare la sintomatologia di ALS in ratti esprimendo TDP-43 in tutto il midollo spinale. Il metodo è coda vena iniezioni di TDP-43 vector per giovani ratti adulti come usato in Jackson et al. 6 , 8 , 9 dopo diverse settimane, i deficit del motore indotta da TDP-43 sono segnati con due metodi: fuga reflex e rotarod come usato in Dayton et al e Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 per il vettore GFP di controllo, nelle analisi post-mortem, zona fluorescente del cervelletto è calcolata come un indice di efficienza di trasduzione come usato in Jackson et al. 6 , 8 l’analisi del cervelletto ha dimostrato di essere un indice rapido e affidabile del grado di trasduzione CNS dopo la consegna del gene periferico e dovrebbe essere applicabile a una varietà di approcci di tentare di trasferimento genico centro-periferico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una varietà di percorsi di consegna sono stati testati per i vettori di AAV: intra-parenchimali, intra-intracerebroventricolare, intra-tecale, endovenosa, intranasale, intra-muscolare, ecc. Ogni itinerario può avere vantaggi specifici, così come gli svantaggi. Amministrazione di coda vena di AAV ai ratti adulti è un metodo affidabile per la realizzazione coerente trasduzione dello SNC. Il metodo di iniezione periferica evita l’introduzione di una cannula di iniezione nei tessuti CNS e pertanto è come minimo dilagant…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx e una donazione di beneficenza per la ricerca sulla SLA da Thomas Lawson, per cui siamo grati. Ringraziamo Elysse Orchard e Donna Burney per consulenza e formazione. JAS è stata sostenuta dalla Fondazione ha mentito e National Institutes of Health concedere GM103418.
Materials
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
Referencias
- Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
- Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
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