לצידו. אור: בויוו ניטור של דלקות Biofilm Pseudomonas aeruginosa לפצעים כרוניים במודל מאתר של שיער סוכרתית
Summary
כאן נתאר מודל מאתר סוכרתית הרומן ניצול עכברים שיער ניטור בזמן אמת, לא פולשנית, זיהומים בפצע biofilm של ביולומנאסן Pseudomonas aeruginosa. בשיטה זו ניתן להתאים כדי להעריך את זיהום של אחרים חיידקים ומיקרואורגניזמים מהונדסים, כולל biofilms מינים רב, ולבדוק את היעילות של אסטרטגיות antibiofilm.
Abstract
הנוכחות של חיידקים כמו biofilms מובנית בלפצעים כרוניים, במיוחד בחולים סוכרתיים, נחשב למנוע ריפוי הפצע והרזולוציה. מודלים פצעים כרוניים העכבר שימשו כדי להבין את האינטראקציות הבסיסית בין המיקרואורגניזמים לבין המארח. המודלים שפותחו כדי תאריך מסתמכים על השימוש בבעלי חיים עם שיער ואוסף מסוף רקמת הפצע על הנחישות של חיידקים קיימא. בעוד תובנה משמעותית צבר עם מודלים אלה, הליך ניסיוני זה דורש מספר רב של בעלי חיים, הדגימה הוא זמן רב. פיתחנו מודל מאתר רומן המשלב מספר חידושים אופטימלית כדי להעריך את התקדמות biofilm לפצעים כרוניים:) הוא מנצל עכברים שיער, ומבטלת את הצורך עבור הסרת שיער; ב) מחיל את biofilms הקבועים מראש על הפצעים ומאפשר את הערכה מיידית של התמדה ותוצאה של קהילות אלה במחשב מארח; ג) מפקח על התקדמות biofilm מאת לכימות ייצור אור על ידי זן ביולומנאסן מהונדס גנטית של Pseudomonas aeruginosa, המאפשר ניטור בזמן אמת של הזיהום ובכך להפחית את מספר בעלי חיים נדרש לכל מחקר. במודל זה, פצע מלא-עומק יחיד המיוצר על גב STZ-induced בעכברים שיער סוכרתיים, מחוסן עם biofilms של המתח ביולומנאסן aeruginosa פ Xen 41. פלט אור מהפצע נרשם מדי יום אין ויוו מערכת הדמיה, המאפשר ויזואליזציה biofilm מהירה ב- vivo וב -באתרו ולוקליזציה של חיידקים biofilm שבתוך הפצעים. שיטה חדשנית זו הוא גמיש כמו זה יכול לשמש כדי ללמוד מיקרואורגניזמים אחרים, כולל מינים מהונדסים biofilms מינים רב, וייתכן ערך מיוחד בבדיקות אסטרטגיות אנטי-biofilm כולל רטבים ריטלין מיקרוביאלית.
Introduction
Biofilms הן קהילות מורכבים של מיקרואורגניזמים מוטבע בתוך מטריצה של חומרים פולימריים הודגשו כגורם תורם לפתרון המסכן לפצעים כרוניים1. המחקר של אוכלוסיות חיידקים אלה מאורגן, מתמיד חשוב במיוחד לחולי הסוכרת לאן מובילה במחזור עניים על איבריו ואת מנגנוני חישה היקפיים שינו נגעים מבלי שיבחינו2. בארצות הברית, ההערכה היא כי 15% של חולי סוכרת יפתחו כיב אחד לפחות במהלך חייהם. זה מתורגם הוצאה כלכלית של-28 מיליארד דולר טיפול3,4, שלא להזכיר את הנטל הרגשי והחברתי immensurable. הבנת הגורמים המאפשרים קהילות מיקרוביאלי להמשיך להעמיד את מיטת הפצע ואת ההשפעה ש-biofilms אלה יש באירועים הריפוי הכרחי כדי לנהוג לטיפול טוב יותר בחולים המושפעת להניע הפיתוח של גישות טיפול חדשות. לכן, הקמת לתרגום הדירים ויוו מודלים עבור חקר אינטראקציות וקרקע הוא בעל חשיבות עליונה.
מודלים מאתר פותחו בהצלחה לחקור את ההשפעה של biofilms הפצעים כרונית. מודלים אלה, עם זאת, לעיתים קרובות לנצל מינים שיער והערכת biofilm אישור מאת צלחת ספירות עבור תאים חיידקיים קיימא של רקמת נכרת מחיות שהקריבה עצמה, שהופך אותם זמן רב ויקר.
אלטרנטיבה biophotonic הדוגמאות נקודת הקצה של חיות הערכת זיהום הועלתה לראשונה על ידי Contag et al. (1995) 5 , מי שפיתח שיטה ללכידת הפריה חוץ גופית של ביולומנאסן צורונים סלמונלה typhimurium כדי למדוד את יעילות טיפול אנטיביוטי. מחקרים אחרים ניצול של חיידקים פולטי ביולומינסנציה בעקבות. לדוגמה, Rochetta et al. (2001) 6 לאמת מודל זיהום ללמוד Escherichia coli זיהומים הירך בעכברים על ידי מדידת הפריה חוץ גופית באמצעות של והחרפת תשלום מצמידים מכשיר, Kadurugamuwa מאוחר יותר, ואח. (2003) 7 ניצלו הפוטון פולטות מאפייני זן שעברו הנדסה לאחור של Staphylococcus aureus כדי לחקור את היעילות של אנטיביוטיקה מספר במודל הפצע קטטר בעכברים.
השיטה מאופיין כאן מציג פרוטוקול פשוטה לגרום סוכרת בעכברים שיער, לייצר ואת לחסן פצעים עם הקבועים מראש biofilms ביולומנאסן של פ aeruginosa, התנהגות biophotonic ניטור הזיהום באמצעות יישום ויוו מערכת הדמיה. הוא מציע ישיר, מהירה, בחיי עיר, תהליך פולשני כמותיים להערכת biofilms לפצעים כרוניים, בנוסף, מאפשרת לניתוח נוספים כגון הדמיה מיקרוסקופיים של ריפוי פצעים, איסוף דם לסירוגין במשך ציטוקין מדידות, אוסף רקמה מסוף עבור כפפות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נתאר מודל עכבר חדש לחקר biofilms סכרת הפצעים כרונית בעלת יתרונות רבים כדי ליצור מודל גמיש, לתרגום הדירים.
החידוש הראשון הוא השימוש של עכברים חסרי־השיער שמסתובבים באזור. דגמים אחרים העכבר פותחו כדי ללמוד סוכרת פצע כרוני ריפוי10,11, אבל כולנו צרי…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות האגודה האמריקנית לסוכרת לתמיכה עבודה זו (גרנט # #7-13-BS-180), מישיגן סטייט אוניברסיטת טכנולוגיה תמיכה במתקן המחקר למתן הכשרה וגישה אל ה- ויוו מערכת הדמיה ו מישיגן המדינה אוניברסיטת חקירה Histopathology מעבדה לעיבוד והביופסיות העכבר לבדיקה histopathological.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
Referencias
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
